CRISPR) hè una tecnica di mudificazione di u genomu di terza generazione: CRISPR hà rivoluzionatu u mondu

CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats) hè una tecnica di edizione di u genomu di terza generazione chì hà rivoluzionatu u mondu cù i so risultati à altu rendimentu. Hè stata aduprata per trattà diverse malatie biologiche è infezioni. Diversi batteri è altri procarioti (cum'è l'archea) anu ancu sistemi CRISPR/Cas9 per difende si contr'à i fagi. Hè statu signalatu chì e strategie basate nantu à CRISPR/Cas9 ponu inibisce a crescita è a progressione di u cancru di u senu triplu negativu (TNBC) mirendu à i geni di resistenza potenzialmente alterati, a trascrizione è a regulazione epigenetica. Queste intervenzioni terapeutiche ponu aiutà à risolve prublemi difficili cum'è a resistenza à i farmaci osservata ancu in TNBC. Attualmente, diversi metudi sò aduprati per furnisce CRISPR/Cas9 à e cellule bersagliu, cum'è fisicu (microiniezione, elettroporazione è modi idrodinamici), virale (virus adeno-associati è lentivirus) è non virale (liposomi è nanoparticelle lipidiche). )-particelle). Ancu s'è parechji mudelli sò stati sviluppati per studià e cause moleculari di u TNBC, a mancanza di metudi sensibili è mirati per furnisce strumenti di mudificazione di u genomu in vivo limita a so applicazione clinica. In riassuntu, sta rivista esamina in modu cumpletu i progressi, e sfide, i limiti è e prospettive di u trattamentu CRISPR/Cas9 per u TNBC basatu annantu à l'evidenza esistente. Evidenziemu ancu cumu a cumbinazione di l'intelligenza artificiale è di l'apprendimentu automaticu pò migliurà e strategie CRISPR/Cas9 in u trattamentu di u TNBC.
U cancru hè carattarizatu da una divisione cellulare incontrollata, una disrupzione di i punti di cuntrollu di u ciclu cellulare è mutazioni in i geni suppressori di tumori (TSG) (Matthews et al., 2022). Trà i sfarenti tippi di cancru, u cancru di u senu hè u tipu di cancru più cumunu in e donne è hà un altu tassu di mortalità in u mondu sanu (Waks è Winer, 2019). U cancru di u senu hè una malatia eterogenea cù diverse caratteristiche, cum'è e caratteristiche istologiche è biologiche, a presentazione è u cumpurtamentu clinicu, è a risposta à u trattamentu (Weigelt et al., 2010). A classificazione di u cancru di u senu furnisce informazioni precise per a diagnosi di u cancru di u senu è a prognosi di u tumore. L'usu di biomarcatori cumuni è caratteristiche clinicopatologiche hè statu u criteriu principale per a classificazione di u cancru di u senu (Tsang è Tse, 2019). A prognosi è a risposta à u trattamentu di u cancru di u senu sò influenzate da numerosi fattori, cumprese a presenza di u receptore di l'estrogeni (ER), u receptore di u progesterone (PR), u receptore 2 di u fattore di crescita epidermica umana (HER2/neu), è u gradu istologicu, u tipu di tumore è u gradu. dimensione è metastasi di i linfonodi (Al-Tubaiti, 2020). Cinque sottotipi moleculari intrinsechi di cancru di u senu sò stati identificati, cumpresi luminal A, luminal B, arricchitu in HER2, basal-like è claudina-low (Prat et al., 2015). TNBC hè un sottotipu moleculare di cancru chì ùn esprime micca tutti ER, PR è HER2 (Yin et al., 2020). Queste caratteristiche patologiche sò assuciate à TNBC, cunfermendu a so rapida progressione è a so natura più aggressiva chè qualsiasi altru tipu di cancru di u senu (Feng et al., 2018). Inoltre, Peru et al (2000) anu utilizatu a tecnulugia di microarray per riclassificà u cancru di u senu è identificà cinque sottotipi intrinsechi di cancru di u senu (Cadenas, 2012). U cancru di u senu basal-like hè un sottotipu di cancru di u senu chì hà un fenotipu triplu negativu è hè assuciatu à una rapida progressione. Ci vole à nutà chì tutti i cancri di u senu di tipu basale sò cumunemente diagnosticati erroneamente cum'è TNBC, ma solu u 77% sò TNBC; In cuntrastu, u 71-91% di i TNBC sò di tipu basale, ciò chì indica chì sti dui tipi di cancru di u senu si sovrapponenu è rapprisentanu classificazioni diverse (Wang D.-Y. et al., 2019). Questu crea a necessità di caratterizà l'eterogeneità di TNBC per elucidà a prognosi è identificà e risposte potenziali à i trattamenti attuali è futuri. Inoltre, TNBC rapprisenta u 15-20% di tutti i casi di cancru di u senu è hè più cumunu in e donne di menu di 50 anni. Mutazioni BRCA1 o BRCA2 sò state segnalate in circa u 20% di i casi TNBC (Xie et al., 2017; Tzikas et al., 2017). , 2020). Studi anu ancu dimustratu chì u TNBC hà un microambiente immune distintu chì include alti livelli di fattori di crescita endoteliale vasculare, macrofagi assuciati à u tumore (TAM), linfociti infiltranti u tumore (TIL) è altre molecule implicate in a crescita è a migrazione di u tumore. Dunque, capisce u microambiente di u TNBC hè cruciale per a so prognosi è u so trattamentu (Fan è He, 2022).
Per valutà a prognosi di u TNBC è assicurà un trattamentu efficace, hè impurtante una diagnosi precisa, basata principalmente nantu à l'immunoistochimica (IHC) per rilevà ER, PR è HER2, è a mammografia per rilevà i neoplasmi di u senu. Tuttavia, a mammografia ùn pò micca rapprisintà adeguatamente e caratteristiche intratumorali cum'è a necrosi è a fibrosi (Deepak Singh et al., 2021). Siccomu una prognosi è una diagnosi scadenti impediscenu à i medichi di prescrive i medicamenti adatti (Chaudhary, 2020), diverse strategie sò aduprate per migliurà a cura di i pazienti cun TNBC. Attualmente, dui medicamenti, doxorubicina è ciclofosfamide, sò aduprati in i pazienti cun TNBC è anu mostratu boni risultati. Inoltre, altri medicamenti di platinu sò aduprati, cum'è carboplatinu è cisplatinu (Sikov et al., 2015). Inoltre, l'inibitori di PARP cum'è Olaparib, Velaparib è PF-01367338 sò stati aduprati cum'è potenziali medicamenti chemioterapici per u trattamentu di TNBC (Ishino et al., 2018). Siccomu e vie di segnalazione Wnt/b-Catenin, NOTCH, è Hedgehog sò state segnalate cum'è implicate in l'apparizione è a progressione di TNBC, indirizzà i farmaci à queste vie pò esse una strategia impurtante (Aysola et al., 2013). Ancu s'è a chirurgia, a radioterapia è a chemioterapia restanu oghje u pilastru di u trattamentu per TNBC, sò stati fatti progressi significativi in ​​u sviluppu di novi trattamenti, cumprese a terapia mirata, l'immunoterapia, vari strumenti di edizione genica ligati à CRISPR cum'è Cas9n, dCas9., CRISPR/Cas12, l'edizione iniziale è a terapia genica mirata à CRISPR/Cas9. Quì ci concentreremu nantu à vari strumenti di edizione genica ligati à CRISPR utilizati in u trattamentu di TNBC. Frà elli, CRISPR/Cas9 hà ricevutu una attenzione diffusa.
Cas9n, cunnisciutu ancu cum'è Cas9 nickase, hè una variante geneticamente mudificata di a proteina Cas9 derivata da u sistema di edizione di u genomu CRISPR/Cas9 (Gupta et al., 2019). In a so forma originale, a proteina Cas9 cuntene dui duminii nucleasi: RuvC è HNH, a funzione principale di i quali hè a scissione di i dui filamenti di DNA. Tuttavia, in Cas9n, unu di i duminii nucleasi, HNH, hè mutatu geneticamente è diventa inattivu. Dunque, u duminiu HNH di Cas9n ferma micca funzionale. Solu u duminiu RuvC ferma attivu, permettendu à Cas9n di taglià o creà rotture nantu à i singoli filamenti di DNA (Trevino è Zhang, 2014). In paragone cù Cas9, Cas9n pò riduce efficacemente l'effetti fora di u bersagliu è migliurà accuratamente i meccanismi di riparazione cellulare. Cas9n pò esse adupratu per risolve diversi prublemi, cum'è a creazione di rotture in lochi specifici in u DNA à doppia catena. Per questu scopu, duie molecule Cas9n sò state cumminate è aduprate inseme (Yee, 2016). A chinasi di lignaggio misto 3 (MLK3) hè una proteina chinasi attivata da mitogeni chì serve cum'è un regulatore chjave durante a metastasi TNBC (Cronan et al., 2012).
MLK3 pò attivà parechje vie di segnalazione chì portanu à metastasi di TNBC. Per esempiu, a via di a chinasi N-terminale c-Jun (JNK) regula a motilità cellulare è a degradazione di a matrice extracellulare, è MLK3 attiva a via JNK, aumentendu cusì a motilità cellulare è conferendu proprietà invasive (Rattanasinchai è Gallo, 2016). MLK3 regula ancu EMT. Per fà questu, attiva i fattori di trascrizione a valle cum'è Snail, Slug è Twist. Quessi fattori inibiscenu l'espressione di marcatori epiteliali è prumove l'espressione di marcatori mesenchimali, purtendu à l'acquisizione di un fenotipu metastaticu (Casalino et al., 2023). Hè statu osservatu chì MLK3 ghjoca un rolu in u rimodellamentu di a MEC è l'attivazione di proteasi cum'è e metalloproteinasi di matrice (MMP) chì degradanu a MEC. Questu facilita l'invasione di e cellule tumorali è a diffusione in siti distanti (Katari et al., 2019). Cusì, studii precedenti anu dimustratu chì MLK3 ghjoca un rolu criticu in TNBC. Rattanasinchai è Gallo anu utilizatu mudelli TNBC per studià u rolu di MLK3 è anu scupertu chì prumove u sviluppu di u cancheru per via di vie di segnalazione specifiche. Anu utilizatu CRISPR/Cas9n per edità MLK3 è anu osservatu una riduzione significativa di e metastasi TNBC (Rattanasinchai è Gallo, 2016).
dCas9, spessu chjamatu Cas9 inattivu, hè una forma derivata mudificata di a proteina Cas9. À u cuntrariu di Cas9 attivu, dCas9 ùn hà micca attività endonucleasica, ciò chì u rende incapace d'induce rotture à doppia catena di DNA. Dunque, dCas9 pò esse adupratu per indirizzà precisamente regioni specifiche di u genomu senza alcun cambiamentu o mudificazione à a sequenza di DNA (Wang et al., 2016). In dCas9, duie proteine ​​endonucleasiche, RuvC è HNH, sò inattivate supprimendu impurtanti residui di aminoacidi. (Richter et al., 2016). Malgradu a so mancanza d'attività di scissione di u DNA, dCas9 ghjoca una quantità di roli impurtanti in a ricerca genetica è a biotecnologia. Per esempiu, permette a visualizazione di regioni specifiche di u genomu, facilita a regulazione trascrizionale è prumove mudificazioni epigenetiche (Brocken et al., 2018).
U fattore di trascrizione ZEB1 (zinc finger E-box binding homeobox 1) ghjoca un rolu specificu è criticu in a mediazione di a transizione epiteliale-mesenchimale (EMT), un prucessu cellulare chì si verifica durante u sviluppu embrionale, a riparazione di i tessuti è a progressione di u cancheru. Implica a trasfurmazione di e cellule epiteliali in cellule mesenchimali, risultendu in cambiamenti in a morfologia cellulare, a motilità, l'invasività, ecc. (Wu et al., 2020). ZEB1 inibisce parechji marcatori epiteliali, cum'è E-caderina è Occludina, chì sò rispunsevuli di u mantenimentu di l'adesione cellula-cellula è a polarità di e cellule epiteliali in TNBC (Moreno-Bueno et al., 2008). Inoltre, ZEB1 attiva certi marcatori cum'è N-caderina, vimentina è fibronectina (Konradi et al., 2014) è regula ancu i geni implicati in u rimodellamentu di u citoscheletru cum'è Rho GTPasi è metalloproteinasi di matrice (MMP) (Huang et al., 2014). 2022), in più, affetta ancu diverse vie di segnalazione cum'è u fattore di crescita trasformante-β (TGF-β), a segnalazione Wnt, ecc., prumovendu cusì l'invasione tumorale è a metastasi in TNBC (Chen et al., 2016). Numerosi studii è evidenze scientifiche indicanu chì ZEB1 hà un grande putenziale cum'è agente preziosu per a rilevazione è l'interventu terapeuticu di TNBC. In un studiu recente, Waryah et al. anu utilizatu un mudellu TNBC è anu ottenutu una soppressione cumpleta di ZEB1 da dCas9. Cusì, anu osservatu una specificità assai alta è una inibizione quasi cumpleta di ZEB1 in cundizioni in vivo (Waryah et al., 2023).
CRISPR/Cas12 hè un strumentu di mudificazione genetica chjamatu CRISPR/Cpf1. Hè derivatu da u sistema CRISPR/Cas, induve u termine Cas12 si riferisce à a proteina 12 assuciata à CRISPR (Bharathkumar et al., 2022), chì hè cumpletamente simile à Cas9. L'unica differenza hè chì cuntene a proteina Cas12. In paragone cù Cas9, Cas12 hà alcune funzioni uniche cum'è a generazione di estremità appiccicose durante u prucessu di mudificazione genetica, mentre chì Cas9 genera estremità smussate (Wang et al., 2021). Sta pruprietà di Cas12 cuntribuisce à a so tecnulugia specifica di manipulazione di u DNA. Cum'è una proteina capace di ricunnosce è taglià precisamente u DNA bersagliu, hà una versatilità straordinaria, chì a rende un strumentu efficace per una varietà di applicazioni, cumprese a mudificazione genetica (Pickar-Oliver è Gersbach, 2019).
Simile à altre varianti CRISPR, CRISPR/Cas12 hè ancu capace di eliminà o attivà i geni in TNBC, mirendu i geni chì ghjocanu un rolu impurtante in a so patogenesi o risposta à u trattamentu (Yang è Zhang, 2023). Per realizà stu prucessu, hè statu sviluppatu un RNA guida (gRNA) chì dirige Cas12 versu u genu bersagliu. Una volta chì Cas12 si lega à u so bersagliu, introduce rotture à doppia catena in u DNA è attiva i meccanismi di riparazione di u DNA. Durante u prucessu di riparazione, ponu esse incorporati nucleotidi sbagliati, purtendu à mutazioni geniche è perdita di funzione (Zhang et al., 2021a). Inoltre, hè stata ancu aduprata una versione migliorata di l'enzima Cas12 (chjamata dCas12) per attivà i geni. Cumbinendulu cù un attivatore di trascrizione, hè pussibule induce certi geni, attivenduli cusì. Sta tecnulugia hà un grande putenziale per prumove l'attivazione di geni soppressori di tumori (Sultan et al., 2022).
L'editing prime hè una tecnulugia di edizione di u genomu sviluppata di recente è estremamente superiore. Hè capace di mudificà u DNA di un urganisimu assai precisamente (Chen è Liu, 2023). L'editing prime hè ottenutu per mezu di l'integrazione di dui cumpunenti principali: un enzima CRISPR/Cas9 mudificatu è una trascrittasi inversa. U rolu di l'enzima CRISPR/Cas9 hè di indirizzà selettivamente siti precisi in u genomu, mentre chì a trascrittasi inversa aiuta à mudificà cumpletamente u DNA in a locu di destinazione (Hassan et al., 2021). In u mecanismu di edizione di primer, u primu passu implica a creazione di un RNA guida di edizione di primer (pegRNA) (Standage-Beier et al., 2021). Contene a sequenza di destinazione è u mudellu di RNA currispondente à u situ di edizione desideratu in u DNA di destinazione. U pegRNA hè tandu introduttu in e cellule di destinazione inseme cù una nucleasi di edizione di primer (PE2). PE2 hè una proteina di fusione custituita da un enzima Cas9, una trascrittasi inversa è un adattatore di edizione di primer (Martín-Alonso et al., 2021). Dentru à a cellula, i cumplessi di pegRNA è PE2 cercanu u DNA specificu ch'elli volenu mudificà. L'enzima Cas9 taglia u DNA è crea un mudellu custituitu da filamenti singuli (Choi et al., 2022). A trascrittasi inversa usa stu mudellu per preparà u DNA per a mudificazione. In più di a copia di u DNA, sò incluse ancu l'istruzzioni per a mudificazione di u mudellu di RNA. Infine, u filamentu di DNA appena creatu hè adupratu cum'è mudellu per riparà a rottura in u DNA, risultendu in una sequenza di DNA alterata chì cuntene a mudificazione desiderata (Ochoa-Sanchez et al., 2021). I meccanismi di mudificazione di u primer ponu purtà à mutazioni diffuse in i geni. Pò indirizzà mutazioni puntuali, inserzioni, delezioni è ancu rimpiazzamenti di geni (Anzalone et al., 2019; Chen è Liu, 2023). A mudificazione di u primer offre parechji vantaghji rispetto à e tecnulugie precedenti di mudificazione di u genomu. Quessi includenu una maggiore precisione, effetti fora di u bersagliu ridutti è a capacità di mudificà u DNA senza affidà si à e rotture à doppiu filamentu di DNA (Anzalone et al., 2020).
A tecnulugia CRISPR/Cas9 hè stata inizialmente sviluppata per prutege i batteri da u trasferimentu di plasmidi è l'infezzione da fagi è hè stata dopu riutilizzata cum'è un strumentu efficace di targeting di u DNA basatu annantu à l'ARN per a mudificazione di u genomu (Jiang è Doudna, 2017). Inoltre, hè statu signalatu chì u sistema CRISPR/Cas9 hè presente in u 50% è l'87% di i genomi batterichi è archeali, rispettivamente (Ishino et al., 2018). CRISPR/Cas9 hè un strumentu putenziale per a cancellazione, l'inserzione è a currezzione di qualsiasi sequenza genetica anormale utilizendu i modi in vivo è in vitro (Sabit et al., 2021). Inoltre, hè statu dimustratu chì CRISPR/Cas9 face parte di u sistema immunitariu adattivu per via di a so specificità per i geni bersagli d'interessu (Chen è Zhang, 2018).
CRISPR/Cas9 hè custituitu da Cas9 è un unicu RNA guida (sgRNA). Cas9 hè un'endonucleasi cumposta da parechji cumpunenti proteichi. Inoltre, Cas9 hà proprietà strutturali è cunfurmazionali uniche (Pacesa et al., 2022) postu chì hè custituitu da dui lobi: ricunniscenza (REC) è nucleasi (NUC). U lobu REC hè ancu divisu in trè regioni: REC1, REC2, è eliche di ponte (Cromwell et al., 2018). U NUC hè custituitu da trè lobi, vale à dì RuvC (RuvC I, RuvC II, RuvC III), HNH è u duminiu d'interazzione di u mutivu adiacente protospacer (PAM) (Fig. 1) (Song et al., 2016). sgRNA hè custituitu da dui cumpunenti, cumpresi l'RNA CRISPR (crRNA) è u picculu RNA transcodificante (RNA tracciante) (Figura 1). U sgRNA cunnetta a proteina Cas9 à e connessine per furmà un cumplessu attivu, cunnisciutu ancu cum'è u cumplessu effettore (Richter et al., 2012). U crRNA hè una coppia di basi di 18-20 nucleotidi chì ghjoca un rolu cruciale in u ricunniscimentu di e sequenze di DNA bersagliu. Inoltre, u crRNA si accoppia cù u DNA bersagliu, è u tracrRNA agisce cum'è una impalcatura per a nucleasi Cas9 per ligà u DNA bersagliu (Manghwar et al., 2019). D’altronde, a sequenza PAM hà 3 nucleotidi, chì cunferma, specifica è media u ligame di u cumplessu effettore à u DNA. E subunità di u cumplessu proteicu Cas9 RuvC è HNH anu attività catalitica (Richter et al., 2012; Asmamaw è Zawdie, 2021). U duminiu nucleasicu HNH di a subunità Cas9 taglia u filamentu di DNA assuciatu à u crRNA. U duminiu nucleasicu RuvC scinde altri filamenti di DNA è genera rotture à doppiu filamentu (DSB), dopu à chì dui diversi meccanismi di riparazione di rotture di DNA sò attivati ​​(Jiang è Doudna, 2017) (Figura 1).
Figura 1. Panoramica di CRISPR/Cas9 (A). Cumponenti di u sistema CRISPR/Cas9: (i). L'endonucleasi Cas9 hè rispunsevule di taglià a sequenza di DNA bersagliu, (ii) un unicu RNA guida (sg) risultante da a fusione di chimere crRNA è tra-crRNA. (dui). Cas9 include parechji cumpunenti cum'è Rec I, Rec II, lobu NUC (HNH è Ruv C sò sottocumponenti) è duminiu d'interazzione PAM (C) cù funzioni currispondenti. U cumplessu proteicu CRISPR/Cas9 scinde e sequenze di DNA in forme non cumplementari è cumplementari (D). CRISPR/Cas9 edita u genomu in trè tappe: ricunniscenza, tagliu è riparazione. L'sg-RNA cuncipitu guida Cas9 è ricunnosce a sequenza desiderata attraversu u cumpunente cumplementare crRNA. Cas9 ricunnosce a sequenza PAM à 5'-NGG-3' è fonde u DNA, furmendu un ibridu DNA-RNA è attivendu a scissione. U duminiu HNH di Cas9 taglia u filamentu cumplementariu, è u duminiu RuvC taglia u filamentu micca cumplementariu. CRISPR/Cas9 ripara u dsDNA rumpendulu in dui modi: unione di estremità micca omologhe (NHEJ) è riparazione diretta da omologia (HDR). NHEJ ripara u DNA à doppia catena in assenza di DNA omologu straneru per mezu di un prucessu enzimaticu, un mecanismu propensu à l'errore chì pò inserisce o rimuovere sequenze di DNA aleatorie. L'HDR hè assai specificu è richiede mudelli di DNA omologhi.
I percorsi di riparazione mediati da CRISPR/Cas9 includenu meccanismi di unione di estremità non omologhe (NHEJ) è di riparazione diretta da omologia (HDR). NHEJ hè un percorsu propensu à l'errore perchè implica l'inserzione o a cancellazione è ùn richiede alcun schema durante u mecanismu di riparazione. Utilizza nucleotidi aleatorii per generà proteine ​​standard (Abbasi et al., 2021). Stu sistema di riparazione hè custituitu da quattru cumplessu cum'è u cumplessu KU, u cumplessu proteicu di cumplementazione incrociata di tipu 4 (XRCC-4), l'enzima di trasfurmazione di l'estremità di u DNA è a protein chinasi DNA-PKcs (Abbasi et al., 2021). A proteina cumplessa KU hà duie subunità, Ku 70 è Ku 80, è ghjoca un rolu impurtante in u mecanismu NHEJ, postu chì u mecanismu di riparazione hè iniziatu da u ligame di duie subunità (Ku 70 è Ku 80) à l'estremità smussate o quasi smussate di u DNA bersagliu (Abbasi et al., 2021), servendu cum'è impalcatura per reclutà altri fattori ligati à NHEJ à u situ di a ferita (Yang et al., 2020). XRCC-4 è a DNA ligasi sò cumposte da 334 è 911 aminoacidi, rispettivamente, è u cumplessu XRCC4-DNA ligasi IV stimula a ligazione di l'estremità di u DNA (Chatterjee et al., 2015). L'enzima di trasfurmazione di l'estremità di u DNA, cunnisciutu ancu cum'è polinucleotide chinasi 3'-fosfatu, hè un enzima di trasfurmazione di l'estremità di u DNA. Pò rimuovere u gruppu 3'P in u DNA è fosforilà u gruppu 5'OH durante a riparazione DSB. Implica ancu a riparazione di e rotture à filu unicu (SSB) utilizendu a via di riparazione SSB (Chatterjee et al., 2015). A protein chinasi DNA-PKcs hè una protein chinasi dipendente da u DNA chì consiste in una subunità catalitica di i PIKK (chinasi correlate à a fosfatidilinositolo 3-chinasi) è a famiglia mutata di atassia telangiectasia (ATM), è ancu ATR correlati à ATM è Rad3. Roture di filu (DSB) è rotture à filu unicu (Yue et al., 2020; Peng et al., 2016).
L'HDR hè un mecanismu di riparazione più precisu è adattatu perchè l'infurmazione hè copiata aduprendu a forma intatta di u duplex di DNA omologu, ancu s'ellu richiede a presenza di cromatidi fratelli. Questu accade durante a fase S/G2 di u ciclu cellulare di i mammiferi. L'HDR si verifica principalmente in e spezie di lievito, ma NHEJ hè criticu in i mammiferi (Burma et al., 2006; Abbasi et al., 2021). U mecanismu di riparazione cumpletu hè mostratu in a Figura 1.
Siccomu u TNBC hè causatu da anomalie genetiche è epigenetiche, a currezzione di l'anomalie genomiche/epigenomiche maligne cù CRISPR/Cas9 pò esse un approcciu terapeuticu raghjonevule (Chen et al., 2019). Inoltre, certi fattori di trascrizione implicati in a regulazione trascrizionale specifica di e cellule ponu mustrà caratteristiche uniche di e cellule cancerose, ciò chì suggerisce chì a regulazione trascrizionale pò esse un eccellente approcciu per u trattamentu di u cancru (Drost et al., 2017). Sfruttà queste caratteristiche moleculari di i tumori, cum'è difetti genetichi, epigenetici è trascrizionali, per u sviluppu di farmaci pò migliurà i risultati clinichi è riduce i costi di screening. CRISPR hè un putenziale strumentu di edizione genetica chì pò micca solu rilevà è identificà i bersagli genomichi chì causanu u cancru, ma pò ancu esse adupratu per edità, supprimà è mudificà epigeneticamente l'oncogeni in e cellule umane (Tabella 1) (Ahmed et al., 2021). Parechji screening CRISPR sò stati realizati per circà geni assuciati à i suppressori di tumori, l'oncogeni è a resistenza à i farmaci. L'usu di CRISPR/Cas9 per edità diversi oncogeni TNBC hè mostratu in a Figura 2.
Figura 2. Edizione genetica di diversi oncogeni TNBC cù CRISPR/Cas9 chì hà risultatu in una riduzione di a crescita tumorale è di a metastasi. Quessi oncogeni includenu CDK7, NAT1, UBR5, YTHDF2, ITGA9, CXCR4 è CXCR7, Crypto1, ROR1 è ST8SIA, chì sò implicati in l'apparizione è a metastasi di TNBC.
A migrazione di e cellule cancerose, l'invasione è a transizione epitelio-mesenchimale (EMT) sò assuciate à ITGA9. Studi precedenti anu dimustratu chì ITGA9 hè un attore chjave in a via Notch è ghjoca un rolu interessante in a metastasi di u rabdomiosarcoma (Molist et al., 2020). Inoltre, hè statu trovu chì ITGA9 hè strettamente assuciatu cù a prognosi di i pazienti in parechji tipi di tumore, cumpresu u cancheru di u senu (Wang Z. et al., 2019). Inoltre, l'analisi bioinformatica di ITGA9 hà dimustratu chì a so espressione in TNBC era significativamente più alta chè in altri sottotipi di cancheru di u senu. Livelli elevati di ITGA9 sò assuciati à metastasi tumorali è ricaduta in i pazienti TNBC. L'eliminazione di ITGA9 da CRISPR/Cas9 hà risultatu in proprietà simili à e cellule staminali cancerose (CSC), angiogenesi tumorale, crescita tumorale è metastasi ridutte prumuvendu a degradazione di a β-catenina in TNBC (Wang Z. et al., 2019).
Crypto-1 hè un membru di a famiglia TGF-β è hè cruciale per l'embriogenesi precoce, u mantenimentu di e cellule staminali è a metastasi di u cancheru (Ishii et al., 2021). Cunnisciuta ancu cum'è Tdgf-1, hè una proteina di segnalazione oncogenica ancorata à GPI implicata in a regulazione di a furmazione di a stria primitiva, di u mesoderma è di l'endoderma, è ancu in u stabilimentu di l'asimmetria sinistra/destra in u sviluppu di l'organi di u corpu durante l'embriogenesi (Zhang et al., 2021b). Inoltre, hè statu dimustratu chì Cripto-1 hè implicatu in a transizione epitelio-mesenchimale (EMT) cum'è marcatore di cellule staminali (Zhang et al., 2021b). L'EMT hè cruciale micca solu per diversi prucessi cum'è u sviluppu embrionale, a fibrosi è a guarigione di e ferite, ma ancu per l'invasione è a metastasi di u cancheru. Inoltre, hè statu dimustratu chì Cripto-1 interagisce cù quattru recettori Notch è migliora a so maturazione post-traduzionale (Brandstadter è Maillard, 2019). A via di segnalazione Notch hè cunnisciuta per esse implicata in u mantenimentu di e cellule di u cancru di u senu umanu. Studi anu dimustratu chì u knockout mediatu da CRISPR/Cas9 di Crypto-1 sopprime a crescita è a metastasi di u cancru. Dunque, Crypto-1 puderia diventà un impurtante bersagliu terapeuticu per u TNBC (Castro et al., 2015).
A proteina XCL12 è u so receptore di chemokine CXC (CXCR4 è CXCR7) ghjocanu diversi roli in a proliferazione, a crescita, a migrazione è l'invasione di e cellule cancerose (Wu et al., 2015). Quessi chemocettori sò stati assuciati à u sviluppu di TNBC attraversu parechje vie di segnalazione in mudelli in vivo è in vitro (Wu et al., 2015). Inoltre, l'attivazione di CXCR4 è CXCR7 hè assuciata à una maggiore suscettibilità à metastasi è una prognosi sfavorevole in TNBC (Karn et al., 2022). Dunque, u knockout di CXCR4 è CXCR7 pò diventà geni bersaglio efficaci per u trattamentu di u cancru di u senu, cumpresu TNBC. Un studiu di Yang et al. Yang et al (2019) anu utilizatu CRISPR/Cas9 per co-knockout i geni CXCR4 è CXCR7 è anu trovu chì a proliferazione, a crescita, a migrazione è l'invasione di TNBC eranu significativamente inibite (Yang et al., 2019).
Livelli aumentati di miR-3662, un oncogene TNBC, sò stati osservati in i tessuti di u cancru di u senu (Yi et al., 2022). Hè statu dimustratu chì a riduzione di miR-3662 inibisce a crescita è a metastasi di u tumore di u cancru di u senu sia in vivo sia in vitro (Agarwal è Gupta, 2021). HBP-1 hè un potente inhibitore di a segnalazione Wnt/-catenina è hè probabilmente rispunsevule di a crescita mediata da miR-3662 di e cellule TNBC. Recentemente, Yi et al. anu scupertu chì l'asse miR-3662-HBP1 regula a via di segnalazione Wnt/-catenina in e cellule TNBC (Yi et al., 2022). A causa di a so espressione specifica di u tumore, miR-3662 pò esse un potenziale bersagliu terapeuticu per TNBC. Cusì, a riduzione di miR-3662 mediata da CRISPR/Cas9 pò esse un eccellente approcciu per u sviluppu di novi farmaci per u trattamentu di TNBC.
UBR5 hè una nucleofosfoproteina di 300 kDa chì hè stata identificata cum'è un regulatore chjave di a tumorigenesi, di a metastasi è di a risposta immune in diversi cancri (Shearer et al., 2015; Fu et al., 2023). Hè statu signalatu chì UBR5 hè assai sovraregulatu in i campioni di TNBC è stimula a funzione ERα inducendu a proliferazione per via di a so attività di ubiquitina ligasi (Bolt et al., 2015). Studi di sequenziamentu di l'exomu interu di campioni di TNBC primari anu ancu mostratu una maggiore espressione di UBR5, chì suggerisce u so rolu in u sviluppu di TNBC. Inoltre, a delezione di UBR5 guidata da CRISPR/Cas9 hà mostratu una inibizione significativa di a metastasi è di a crescita di TNBC in mudelli sperimentali di topi. Inoltre, l'inclusione di UBR5 in un mudellu di topo di tipu salvaticu hà restauratu a so piena funzionalità, mentre chì questu effettu ùn hè statu osservatu in ceppi mutanti inattivati ​​(Liao et al., 2017). A mancanza di UBR5 hè assuciata à una maggiore apoptosi, necrosi è inibizione di a crescita tumorale in TNBC per via di una scarsa angiogenesi. A causa di a perdita di UBR5, a diffusione di u tumore à l'organi distanti hè ridutta, è UBR5 induce EMT anormale principalmente riducendu l'espressione di E-caderina (Zhang è Weinberg, 2018). Recentemente, hè statu dimustratu chì UBR5 hè un fattore assai impurtante in a trascrizione di PDL1 indotta da IFN-γ in TNBC per via di a so mancanza di attività di ubiquitinazione E3. L'analisi di u trascrittoma di l'RNA hà rivelatu chì UBR5 pò avè effetti sistemichi nantu à i geni assuciati à a via IFN-γ è prumove a transattivazione di PDL1 aumentendu i livelli di attivazione di l'RNA di a protein chinasi (PKR) è di i so trasduttori è attivatori di segnale. trascrizione 1 (STAT1) è fattore regulatore di l'interferone 1 (IRF1). Tuttavia, l'ablazione cumminata mediata da CRISPR/Cas9 di l'espressione di UBR5 è PD-L1 hà un effettu terapeuticu sinergicu chè qualsiasi bloccu solu, cù effetti prufondi nantu à u microambiente tumorale (Wu et al., 2022). Cusì, CRISPR/Cas9 pò esse un strumentu impurtante per inibisce a funzione UBR5, supprimendu cusì a metastasi di TNBC è a crescita tumorale.
ROR1 hè una proteina transmembrana di tipu I chì hè espressa durante u cancru è u sviluppu embrionale è hè stata identificata cum'è una proteina oncofetale (Nicholas Borcherding, 2014). U cumpurtamentu invasivu di diversi cancri umani hè assuciatu à a sovraespressione di ROR1. Risultati promettenti sò stati ottenuti da studii in vivo è in vitro chì implicanu cumposti terapeutici chì miranu ROR1 (Chien et al., 2016). Livelli elevati di mRNA di ROR1 in biopsie di tissutu mammariu sò stati ancu assuciati à tumori aggressivi di u senu basale (BL) è a so migrazione in altre parti di u corpu. Inoltre, a sovraespressione di ROR1 hè stata identificata cum'è un marcatore prognosticu per u sviluppu di TNBC (Chien et al., 2016). Tuttavia, silenzià ROR1 aduprendu CRISPR/Cas9 per supprime a crescita è a metastasi di TNBC seria una strategia efficace.
U prucessu di sialilazione implica l'aghjunta di l'acidu sialicu à i glicoconiugati, chì hè catalizatu da e sialiltransferasi (ST). ST8SIA1 appartene à a famiglia ST è ghjoca un rolu impurtante in a patogenesi di varie malatie cum'è a leucemia linfocitica è u cancru colorectal (Chang et al., 2018). L'analisi di a sequenza di l'RNA mostra chì ST8SIA1 hè altamente espressu in u tissutu mammariu di i pazienti TNBC è hè pusitivamente correlatu cù mutazioni in u genu suppressore tumorale p53, chì ponu cuntribuisce à a patogenesi di TNBC (Battula et al., 2017). Inoltre, ST8SIA1 hè implicatu in a metastasi è a ricorrenza di TNBC, ciò chì suggerisce chì ghjoca un rolu impurtante in l'apparizione è u sviluppu di TNBC. In un mudellu in vitro di TNBC, hè statu dimustratu chì a soppressione di ST8SIA1 da CRIPSR/Cas9 blocca a crescita è a metastasi (Battula et al., 2017). Questu suggerisce chì CRISPR/Cas9 puderia esse un strumentu impurtante per inibisce a funzione di l'oncogene ST8SIA1 in u trattamentu di TNBC.
NAT1 hè un enzima metabolicu chì catalizeghja a furmazione di cumposti xenobiotici di fase II è hè espressu in quasi tutti i tessuti umani. NAT1 pò aduprà u cofattore folatu per indirizzà l'acetil-CoA (acetil-CoA) ancu in assenza di u sustratu di amina aromatica (Stepp et al., 2015; Laurieri et al., 2014). Studi anu dimustratu chì NAT1 regula a funzione di a metalloproteinasi di matrice 9 (MMP9) in i mudelli di cellule di cancru di u senu è prutege contr'à e spezie reattive di l'ossigenu (ROS) durante a privazione di glucosiu (Wang et al., 2018). Hè statu dimustratu chì a delezione di NAT1 inibisce u cumplessu di piruvato deidrogenasi, purtendu à una disfunzione mitocondriale (Wang L. et al., 2019). Inoltre, diversi altri rapporti anu dimustratu chì l'inibizione di NAT1 aduprendu piccule molecule è u silenziamentu di siRNA pò riduce l'invasività è a proliferazione di e cellule di cancru di u senu (Stepp et al., 2018). Recentemente, CRISPR/Cas9 hè statu utilizatu per supprimà NAT1 in a linea cellulare di cancru di u senu MDA-MB-231, affettendu u metabolismu cellulare secondu u so livellu d'espressione. Stu studiu hà ancu dimustratu chì NAT-1 hè cruciale per a progressione è a metastasi di TNBC (Carlisle et al., 2020).
A trascrizione coordinata di l'oncogeni hè regulata da super enhancers, fattori di trascrizione è cofattori (Hnisz et al., 2015). Inoltre, un gruppu di chinasi dipendenti da cicline (CDK), cum'è CDK7, CDK8, CDK9, CDK12 è CDK13, sò necessarii per a regulazione trascrizionale. Trà elle, CDK7 hè implicata in a fosforilazione di l'RNA polimerasi II, chì hè assai impurtante per l'iniziu è l'espansione di a trascrizione di l'oncogeni in a patogenesi di TNBC. In un studiu seminale, a delezione di CDK7 da CRISPR/Cas9 hà inibitu TNBC, indicendu chì a patogenesi di TNBC hè dipendente da CDK7 (Wang Y. et al., 2015).
Studi anu dimustratu chì e mutazioni in MYC è RBP (proteina legante l'RNA) ponu purtà à l'apoptosi, mentre chì e mutazioni di un solu gene in MYC o RBP ùn affettanu micca a crescita di e cellule cancerose (Einstein et al., 2021). Più di 1000 RBP in u genomu umanu sò stati screening utilizendu una biblioteca basata nantu à CRISPR/Cas9. Frà elle, 57 RBP sò stati trovati critichi per a crescita di e cellule cancerose cù livelli MYC assai elevati (Wheeler et al., 2020). Inoltre, YTHDF2 hè impurtante per mantene a crescita di e cellule TNBC è riduce a quantità di trascritti metilati durante a trascrizione è a traduzzione di altu livellu in e cellule cancerose cù una più alta espressione MYC. Inoltre, YTHDF2 ùn hè micca essenziale per e cellule cancerose, chì sò menu dipendenti da livelli elevati di MYC per prolongà a sopravvivenza di i pazienti TNBC (Einstein et al., 2021), ciò chì suggerisce chì puderia esse un potenziale bersagliu terapeuticu per i farmaci chì ponu superà TNBC.
E proteine ​​di u dita di zincu (ZNF) custituiscenu circa l'1% di u genomu umanu tutale. Studi anu dimustratu chì u ZNF pò regulà a proliferazione cellulare in diversi cancri, cum'è u cancru di u fegatu, u cancru di u senu è u cancru colorectal (Zhang W. et al., 2021; Li et al., 2017). E biblioteche generate da CRISPR knockout sò state aduprate per screening di diversi geni suppressori di tumori (TSG) in cellule di cancru di u senu (Shalem et al., 2014). Da tandu, un studiu trascrittomicu di e cellule di cancru di u senu CRISPR/Cas9 ZNF319-deleted hà dimustratu chì u ZNF319 hè un genu suppressore di tumori chì riduce a proliferazione di u cancru di u senu è hè dunque implicatu in diversi meccanismi di segnalazione potenziali è altre funzioni biologiche (Wang L. et al., 2022).
A ferroptosi hè un tipu di morte cellulare prugrammata chì dipende da a presenza di ferru. Hè cunnisciutu chì u sviluppu di a ferroptosi hè influenzatu da a presenza di perossidi lipidici. Inoltre, hè statu signalatu chì PKCβII presenta una perossidazione lipidica precoce, è una maggiore perossidazione lipidica hè assuciata à a ferroptosi. U screening di una biblioteca di inibitori di chinasi mediati da CRISPR/Cas9 hà rivelatu chì PKCβII hè implicatu in u prucessu di perossidazione lipidica, chì hè cruciale per a ferroptosi in e cellule MDA-MB-231 (Zhang et al., 2022). Dunque, questu suggerisce chì u knockout di PKCβII da CRISPR/Cas9 puderia esse un potenziale bersagliu di genu suppressore tumorale per u trattamentu di e malatie legate à a ferroptosi (Zhang et al., 2022).
Si crede chì a resistenza à i medicinali sia rispunsevule di circa u 90% di i morti in i pazienti cun cancru è hè una di e sfide maiò in u trattamentu di u cancru (Bukowski et al., 2020). I risultati indicanu chì un numeru sufficiente di geni ligati à l'efflussu di medicinali, a riparazione di u DNA, l'apoptosi è diverse vie di segnalazione cellulare sò assuciati à a resistenza à i medicinali (Haider et al., 2020). Frà elli, parechji geni sò stati mirati da l'arnesi CRISPR/Cas9 è anu mostratu risultati promettenti in a riduzione di a resistenza à i medicinali è in l'aumentu di l'efficacità di i trattamenti anti-cancru (Vaghari-Tabari et al., 2022). Inoltre, e biblioteche di screening di knockout di geni CRISPR/Cas9 à altu rendimentu sò state implicate in a mudificazione di a funzione di potenziali bersagli di geni di resistenza à i medicinali (Shalem et al., 2015). Per identificà i geni di resistenza à u paclitaxel, u sequenziamentu di l'ARN accumpagnatu da u screening di a biblioteca sgRNA à livellu di u genomu hè statu utilizatu per identificà ottu geni candidati, cumpresi l'istone deacetilasi 9 (HDAC9), chì sò assuciati à a resistenza à i farmaci in i pazienti cun TNBC ricorrente (B et al., 2020). In un altru studiu, hè stata osservata una maggiore espressione di diserina/treonina è tirosina protein chinasi (DSTYK) durante a sopravvivenza di i pazienti TNBC trattati cù farmaci antitumorali. Inoltre, a soppressione mediata da CRISPR/Cas9 di DSTYK hà aumentatu significativamente l'apoptosi di e cellule cancerose resistenti à i farmaci in vitro (cellule SUM102PT è cellule MDA-MB-468) è un mudellu TNBC in vivo (Ogbu et al., 2021).
Ancu s'è u TNBC hà una attivazione anormale di a via MAPK, l'effettu clinicu di e terapie mirate à MEK hè debule. Un screening di a biblioteca genomica CRISPR/Cas9 hà rivelatu chì l'inibizione di PSMG2 (chaperone 2 di l'assemblaggio di u proteoma) sensibilizza e cellule TNBC BT549 è MB468 à l'inibitore MEK AZD6244. L'inhibizione di CRISPR/Cas9 di PSMG2 hà alteratu a funzione nurmale di u proteasoma, purtendu à u disassemblaggio mediatu da l'autofagia di PDPK1, migliurendu cusì ulteriormente e cellule tumorali in i mudelli di topi TNBC indotti da AZD6244 (inibitore MEK) è MG132 (inibitore di u proteasoma). Cusì, l'inibitori di u proteasoma è di a MAP chinasi (MEK) ponu esse amministrati in sinergia per riduce a proliferazione di e cellule tumorali (Wang X. et al., 2022).
CRISPR/Cas9 hè statu ancu utilizatu per screening per a perdita di funzione genica chì porta à resistenza TNBC (Shu et al., 2020). Ge et al anu spiegatu u mecanismu di resistenza à i medicinali di e cellule cancerose trattate cù JQ1, un inhibitore di bromodomini BET (BBDI), in TNBC. Usendu CRISPR/Cas9, anu trovu chì a cancellazione di u genu rb1 hà fattu chì TNBC diventessi resistente à u medicamentu anti-cancru JQ1. Dunque, a funzione rb1 hè impurtante in a risposta à i medicinali JQ1 in TNBC. Anu ancu signalatu chì paclitaxel hè un inhibitore di chinasi/microtubuli CDK4/6, è a so cumminazione cù BBDI cum'è JQ1 pò furnisce risposte terapeutiche promettenti à TNBC resistente à i medicinali (Ge et al., 2020).
U paisaghju trascrizionale di l'ARN longu non codificante (lncRNA) hè statu signalatu cum'è rispunsevule di a resistenza à a terapia neoadjuvante in u TNBC. Stu studiu mostra chì cinque diverse trascrizioni di lncRNA MALAT1 sò altamente espresse in TNBC. Inoltre, a delezione mediata da CRISPR/Cas9 di MALAT1 hà aumentatu a sensibilità di e cellule TNBC BT-549 à paclitaxel è doxorubicina, suggerendu un putenziale rolu per a resistenza à MALAT1 in TNBC (Shaath et al., 2021).
E mutazioni in BRCA1 (BRCA1m) sò eterogenee è dunque difficili da rilevà. U targeting di PARP1 (poli(ADP-ribose) polimerasi), u cumpagnu letale sinteticu di BRCA1, pò aumentà a chemosensibilità à i farmaci TNBC. Usendu CRISPR/Cas9, a delezione di PARP1 hà aumentatu a sensibilità di i farmaci antitumorali cum'è a doxorubicina, a gemcitabina è u docetaxel à e cellule TNBC mutanti mBRCA1, ciò chì suggerisce chì PARP1 hè ancu implicatu in a resistenza à i farmaci in TNBC (Vaghari-Tabari et al., 2022). . E mutazioni in i geni soppressori di tumori BRCA1 o BRCA2 sò cunnisciute per aumentà a probabilità di sviluppà u cancheru di u senu in e persone. U trattamentu di sti pazienti richiede l'usu di inibitori di PARP. Inoltre, hè statu dimustratu chì l'eliminazione di u fattore di salvezza di nucleotidi DNPH1 cù CRISPR/Cas9 pò eliminà u monofosfatu di nucleotidi tossichi 5-idrossimetildeossiuridina (hmdU), aumentendu cusì a risposta di e cellule cun deficit di BRCA à a sensibilità à l'inibitori di PARP (Fugger et al., 2021). Cusì, l'inibitori di CRISPR/Cas9 è PARP1 ponu diventà una strategia di trattamentu impurtante per u TNBC.
U genu di a glicoproteina penetrante (P-gp) hè un genu di resistenza multidroga chì hè generalmente sovraregulatu in circa u 41% di tutti i TNBC (Sun et al., 2020). L'efflussu di droga induttu da P-gp hè statu identificatu cum'è un regulatore chjave di a resistenza à i medicinali in u cancru di u senu. L'inibitori di P-gp anu dimustratu una maggiore sensibilità à i medicinali antitumorali in u cancru di u senu (Famta et al., 2021). Cusì, l'ablazione o a soppressione mediata da CRISPR/Cas9 di P-gp è l'inibitori di P-gp ponu esse metudi assai impurtanti per superà a resistenza à i medicinali in TNBC.
U trasportatore di cassetta legante ATP G2 (ABCG2) hè cunnisciutu per causà resistenza à i medicinali in TNBC (Palasuberniam et al., 2015), ancu s'ellu ùn ci sò attualmente rapporti nantu à a relazione trà CRISPR/Cas9 è u silenziamentu ABCG2 è l'inattivazione di u genu suppressore tumorale. PTEN pò aumentà l'attivazione di ABCG2 (Palasuberniam et al., 2015), (Deepak Singh et al., 2021). Dunque, l'usu di CRISP/Ca9 per rimuovere ABCG2 è a so cumbinazione cù un inhibitore ABCG2 pò esse un trattamentu adattatu per superà a resistenza à i medicinali in TNBC. A Tavula 2 cita CRISPR/Cas9 chì mira à tutti i geni di resistenza.
Tavula 2. CRISPR/Cas9 hà cum'è scopu diversi geni di resistenza TNBC per sensibilizà e cellule à i medicinali anticancerosi.
E biblioteche CRISPR/Cas9 sò strumenti putenziali per u screening di mutazioni genetiche assuciate à a patogenesi di u cancru (Chan et al., 2022). Stu metudu di screening implica quattru tappe cum'è (a) custruzzione di biblioteche, (b) trasduzione lentivirale, (c) screening fenotipicu, è (d) analisi di u genu bersagliu. Ancu s'è u TNBC hà una attivazione anormale di a via MAPK, a prognosi clinica di a terapia mirata MEK per i pazienti TNBC chì portanu mutazioni in geni suppressori di tumori cum'è PTEN, RB1, è TP53 hè assai scarsa.
Inoltre, un screening di knockout di geni cù CRISPR/Cas9 hà testatu a molecula più putente è selettiva, u deidrocatrol, chì hè abbundante in l'estratti di fiori è foglie guatemaltechi, per capisce l'effettu di u deidrocatrol nantu à MDA-MB-231. Meccanismi di citotossicità cellulare selettiva. Caratteristiche di u fustu mesenchimale di i sottotipi TNBC. Stu screening basatu annantu à CRISPR/Cas9 hà ancu revelatu chì HSD17B11, un genu chì codifica a 17β-idrossisteroide deidrogenasi di tipu 11, hè altamente espressu in e cellule MDA-MB-231 è dà cum'è risultatu deidrofalcarinolu specificu per e cellule MDA-MB-231 (Grant et. al., 2020). Cusì, questu suggerisce chì u screening genomicu CRISPR/Cas9 hà un grande putenziale per identificà i meccanismi chì sò à a basa di e proprietà anticancerose di i cumposti naturali potenziali.
Inoltre, a vulnerabilità di TNBC à u cancru hè stata studiata aduprendu un screening CRISPR/Cas9 in vivo à livellu di genomu imparziale, chì hà mostratu un ligame trà e vie oncogene è di suppressione tumorale. I cumpunenti chjave di e vie mTOR è Hippo sò stati signalati per ghjucà roli impurtanti in a regulazione di u tumore in TNBC. Inoltre, studii anu dimustratu chì l'inibizione farmacologica di l'oncoproteina mTORC1/2 è YAP inibisce efficacemente a patogenicità di TNBC aduprendu un mudellu di sinergia farmaco-matrice in vitro è xenotrapianti derivati ​​da pazienti in vivo. Inoltre, l'inibizione di mTORC1/2 mediata da Torin-1 aumenta a macropinocitosi, mentre chì l'inibizione di YAP indotta da verteporfina porta à a morte cellulare TNBC. Pigliati inseme, questi risultati mettenu in risaltu a putenza è a robustezza di u screening CRISPR in vivo à livellu di genomu per identificà trattamenti novi è efficaci per TNBC (Dai et al., 2021).
A disregulazione di u sistema immunitariu hè un fattore impurtante in a tumorigenesi. E cellule cancerose evitanu l'eliminazione immunitaria bypassendu i meccanismi di difesa, cumprese l'interferenza cù l'attività di e cellule immunitarie in u microambiente tumorale è a compromissione di u sistema immunitariu. Dunque, u sviluppu di un sistema immunitariu miglioratu pò esse un approcciu chjave per luttà contr'à i tumori. L'usu di a mudificazione genetica basata nantu à CRISPR/Cas9 affronta parechji prublemi ligati à a disfunzione immunitaria da diverse prospettive. CRISPR/Cas9 hè statu utilizatu per migliurà l'immunità antitumorale contr'à u cancheru di u senu attraversu e seguenti vie (Figura 3).
Figura 3. L'immunoterapia CRISPR/Cas9 hà cum'è bersagliu e cellule TNBC. A perdita di CDK5 è a soppressione di PDL1 è CD155 rinfurzanu u sistema immunitariu. In listessu modu, a perdita di A2AR è a soppressione di TAA cum'è HER2, mucina 1 è TEM8 anu aumentatu l'efficienza di e cellule CAR-T in l'uccisione di e cellule cancerose. U screening di e cellule T guidatu da CRISPR/Cas9 hà dimustratu chì a disrupzione di a chinasi p38 aumenta l'attività antitumorale di e cellule T. E cellule T mudificate da CRISPR/Cas9 aumentanu l'espressione di TCR (recettore di e cellule T), risultendu in cellule T chì anu attività antitumorale.
L'obiettivu di l'immunoterapia hè di stimulà u sistema immunitariu per attaccà e cellule cancerose. A sovraespressione di e proteine ​​di i punti di cuntrollu immunitariu di solitu impedisce e reazioni autoimmuni, ma pò aiutà i cancri à evità li (Topalian et al., 2015). Queste proteine ​​impediscenu e reazioni immunitarie legandosi à i recettori nantu à a superficia di e cellule immunitarie. Parechje proteine ​​di i punti di cuntrollu (cum'è CD155 è PD-L1) miranu u receptore PD-1 nantu à e cellule immunitarie è sò espresse in u cancru di u senu, in particulare u TNBC (Li Y.-C. et al., 2020). L'inibizione di PD-L1 o di u so receptore cù CRISPR/Cas9 pò stimulà u sistema immunitariu per attaccà i tumori TNBC (Yahata et al., 2019). Inoltre, hè statu dimustratu chì a riduzione di l'espressione di PD-L1 per via di a delezione mediata da CRISPR/Cas9 di CDK5 inibisce a crescita tumorale in vitro è in vivo (Deng et al., 2020). L'inibizione di a crescita in i mudelli in vitro è in vivo di cancru di u senu suggerisce chì a riduzione di CD155 mediata da shRNA puderia avè un effettu terapeuticu nantu à u cancru di u senu (Gao et al., 2018).
I linfociti CAR T esprimenu CAR chì ricunnoscenu l'antigeni assuciati à u tumore (TAA) è ponu aduprà a riduzzione di e proteine ​​di checkpoint per aumentà a so attività (Li C. et al., 2020). Ci sò diversi bersagli potenziali per a terapia cù linfociti CAR T in u cancru di u senu, cumpresi parechji TAA cum'è HER2, mucin1 è TEM8 (Bajgain et al., 2018). Ci hè evidenza chì i linfociti CAR T chì miranu a mesotelina (sovraespressa in e cellule TNBC BT-459) sò più efficaci contr'à u cancru quandu PD-1 hè eliminatu cù CRISPR/Cas9 (Hu et al., 2019). Tuttavia, l'isulamentu di i linfociti T da i pazienti è poi a so mudificazione ex vivo hè un prucessu chì richiede assai travagliu è tempu. Ancu s'è i linfociti T universali ponu riduce i requisiti d'isolamentu, i linfociti T donatori chì esprimenu l'antigenu leucocitariu umanu (HLA) di classe I è u receptore di i linfociti T (TCR) devenu esse rimossi per prevene anomalie di l'injertu contr'à l'ospite (Ren et al., 2017). , 2017a). Cù CRISPR/Cas9, HDR pò eliminà simultaneamente TCR è HLA è eliminà u genu chì codifica CAR. Studi anu dimustratu chì CRISPR/Cas9 pò esse adupratu per introduce CAR anti-CD19 in u locus TCR, producendu cusì CAR in modu efficiente senza esaurisce e cellule T (Dimitri et al., 2022). E tecnulugie multiplex sò state sviluppate per generà cellule T CAR allogeniche eliminendu simultaneamente TCR, beta-2-microglobulina (B2M), subunità HLA-I è altre proteine ​​cum'è PD-1 è CTLA-4, chì ponu avè più proprietà anticancerose contr'à TNBC (Eyquem et al., 2017; Liu et al., 2017; Ren et al., 2017b; Dimitri et al., 2022).
L'usu di CRISPR/Cas9 puderia migliurà l'efficacità di e cellule CAR-T. L'adenosina hè cunnisciuta per avè proprietà immunosoppressive è pò riduce l'immunità anticancerosa bluccendu a funzione di e cellule T è attivendu i recettori di l'adenosina A2A (A2AR) (Vigano et al., 2019). U silenziamentu di A2AR cù CRISPR/Cas9 hà migliuratu significativamente l'efficacità di e cellule CAR-T in vivo (Giuffrida et al., 2021). E cellule T sò cunnisciute per presentà varie caratteristiche fenotipiche cum'è l'espansione cellulare, a differenziazione, u stress ossidativu è u stress genomicu. U screening di e cellule T basatu annantu à CRISPR/Cas9 hà rivelatu a disrupzione di 25 diverse chinasi di i recettori di e cellule T. Trà elle, hè statu dimustratu chì a delezione di a chinasi p38 aumenta l'attività antitumorale di e cellule T, indicendu chì a chinasi p38 hè un regulatore chjave di a regulazione di e cellule CAR-T (Gurusamy et al., 2020).
I linfociti T ponu esse geneticamente mudificati aduprendu CRISPR/Cas9 per pruduce TCR altamente espressi. U trasferimentu di linfociti T geneticamente mudificati à i pazienti hà dimustratu una attività anticancerosa più forte cà i linfociti T endogeni. Dunque, i TCR endogeni ponu cumpete cù i TCR geneticamente alterati in i pazienti, ciò chì pò influenzà u putenziale di l'immunoterapia di u cancheru. Per superà stu prublema, l'usu di CRISPR/Cas9 per rimuovere u TCR-β endogenu in e cellule riceventi è successivamente trasferisce i linfociti T TCR-β à i pazienti cun cancheru pò mustrà migliori risposte immunitarie anticancerose senza a necessità di cumpetizione sessuale endogena per i TCR (Fan et al. 2018). Cusì, cù l'eccezione di i linfociti T mudificati da CRISPR, i TCR sò mille volte più sensibili à l'antigeni tumorali cà i linfociti T trasdotti da TCR nurmali. Inoltre, in varie leucemie, i linfociti T alterati generati da γδ TCR+ CRISPR mostranu una maggiore espressione di linfociti T CD4+ è CD8+ cà u trasferimentu standard di TCR (Legut et al., 2018). Cusì, i linfociti T mudificati generati da CRISPR/Cas9 ponu esse un metudu d'immunoterapia efficace per superà u TNBC.
L'integrine sò molecule d'adesione cellulare chì sò prisenti in e transmembrane cellulari è prumove u ligame di e cellule à a matrice extracellulare (ECM) (Hamidi è Ivaska, 2018). A disregulazione di l'integrine hè assuciata à u sviluppu è a migrazione di u cancheru alterendu a matrice extracellulare, purtendu à a sopravvivenza di e cellule cancerose in a circulazione (Hamidi è Ivaska, 2018). L'inhibizione di l'integrine mediata da CRISPR/Cas9 rallenta a progressione tumorale, a metastasi è a culunizazione in u TNBC. Hè statu signalatu chì l'inhibizione di l'integrina a5 (ITGA5) riduce a migrazione è a progressione cellulare in altri cancri cum'è u cancheru di u pulmone (Ju et al., 2017), ciò chì suggerisce chì l'integrina a5 pò ancu esse un fattore chjave in a patogenesi di u TNBC.
A generazione di topi knockout utilizendu i metudi tradiziunali di cellule staminali embrionali (ES) hè un prucessu chì richiede assai travagliu, tempu è hè inefficiente. Ci vole mesi è anni per indirizzà e cellule ES per mezu di a ricombinazione omologa, allevà topi chimerichi, è poi incrociarli cù topi eterozigoti per pruduce discendenza omozigota. L'incrociu cumplessu hè necessariu per creà topi cù mutazioni genetiche multiple. Tuttavia, parechji prublemi sò sorti quandu si utilizanu topi generati da l'ablazione di cellule ES utilizendu CRISPR/Cas9 o per microiniezione di cumpunenti CRISPR/Cas9 in ova fecundate à una sola cellula. Per esempiu, l'introduzione di cambiamenti si verifica spessu in loci biallelici è ùn hè micca specifica per i geni. Hè statu recentemente riportatu chì e cellule ES chì utilizanu a tecnulugia CRISPR/Cas9 ponu inserisce simultaneamente mutazioni bialleliche finu à 5 geni (Nishizono et al., 2021). Per questu scopu, l'mRNA Cas9 è cinque gRNA specifichi per i geni sò stati trasfettati simultaneamente in cellule ES. Questu mette in risaltu a prumessa è l'efficacità di sta prucedura, ancu s'è ste mutazioni possinu esse state trasmesse quandu e linee fundatrici sò state allevate per pruduce topi quintupli knockout. U studiu riporta ancu una scuperta sorprendente: e cellule ES ùn sò più necessarie per creà topi geneticamente mudificati. Invece, per rimuovere prudutti genetichi specifici, l'mRNA è u gRNA Cas9 sò stati iniettati in embrioni in stadiu unicellulare. Di cunsiguenza, sò state create linee fundatrici knockout chì ponu teoricamente esse aduprate per studià e cunsequenze di a delezione di geni in i topi (Qin et al., 2016). Cusì, CRISPR/Cas9 permette a creazione di topi transgenici per trattà u TNBC à un costu inferiore à l'ingegneria genetica tradiziunale. Usendu u sistema CRISPR/Cas, hè statu sviluppatu un novu mudellu di topu knockout chì pò introduce cù successu mutazioni puntuali in unu o più geni endogeni in u TNBC. Basatu annantu à stu cuncettu, i mudelli animali di TNBC ponu ancu esse sviluppati aduprendu a delezione mediata da CRISPR/Cas9 di BRCA1 è p53, chì risulta in perdita di riparazione HR, instabilità genomica è fenotipi mutanti (Annunziato et al., 2020).
Attualmente, diversi metudi cum'è a mammografia, a risonanza magnetica (MRI) è l'ecografia sò aduprati per diagnosticà u TNBC. Tuttavia, questi metudi anu qualchì limitazione. A mammografia hè aduprata per diagnosticà u tissutu mammariu lucale piuttostu chè e metastasi, induve e cellule cancerose sò migrate versu altri organi. L'ecografia ùn hè micca un metudu affidabile per diagnosticà u TNBC (Chen è Lee-Felker, 2023). A MRI hà una sensibilità più alta chè l'ecografia è a mammografia, ma a so precisione diagnostica hè limitata (Sha è Chen, 2022). A biopsia tissutale hè un modu invasivu per identificà e cellule cancerose. Tuttavia, in certi casi, una biopsia pò mancà u tissutu canceroso se l'agulla si alluntana da a zona d'interessu. Inoltre, hè assai cara è pò esse traumatica per u paziente. U TNBC hè un tipu eterogeneu di cancru, dunque una biopsia ùn pò micca furnisce abbastanza informazioni nantu à u tipu di cancru. Dunque, hè urgentemente necessariu un novu metudu diagnosticu affidabile per rilevà u TNBC. CRISPR/Cas9 pò serve cum'è una alternativa altamente sensibile è minimamente invasiva per a diagnosi di u cancru di u senu. À questu scopu, e strategie basate nantu à CRISPR/Cas9 ponu esse aduprate per migliurà i metudi PCR per a diagnosi di TNBC. Prima, e proteine ​​Cas9 è cpf1 di u sistema CRISPR sò aduprate per rimuovere u DNA non specificu, è dopu queste duie proteine ​​(Cas9 è cpf1) ponu ricunnosce a sequenza PAM prima di ligà si à u DNA bersagliu (Deepak Singh et al., 2021). Cusì, a PCR pò identificà e mutazioni assuciate à u sviluppu di u cancru. Parechji studii anu aduttatu sta strategia basata nantu à CRISPR per rilevà diverse mutazioni in diversi cancri (Safari et al., 2019). Cusì, i metudi PCR basati nantu à CRISPR ponu riduce a dipendenza di a diagnosi di TNBC da metudi invasivi cum'è l'immunoistochimica basata nantu à a biopsia.
I cambiamenti genotipichi in a regulazione di i recettori ormonali sò stati ancu dimustrati in TNBC (Chen è Russo, 2009). E strategie PCR basate nantu à CRISPR/Cas9 chì utilizanu microarrays per a diagnostica in u puntu di cura ponu monitorà efficacemente queste mutazioni (Hajian et al., 2019). Puderia ancu furnisce à i fornitori di assistenza sanitaria informazioni pertinenti nantu à mutazioni specifiche in i pazienti TNBC, chì puderianu aiutà à migliurà u so corsu di trattamentu. Tuttavia, sta tecnica cumminata hà limitazioni. Dunque, sò necessarii sforzi di ricerca estensivi prima chì stu metudu CRISPR/Cas-PCR possi esse adupratu in l'assistenza sanitaria per a diagnosi di TNBC (Yang et al., 2019).