U diagnosticu differenziale di i noduli pulmonari identificati da a tomografia computerizzata (CT) resta una sfida in a pratica clinica.Quì, caratterizzemu u metaboloma glubale di 480 campioni di serum, cumpresi cuntrolli sani, noduli pulmonari benigni, è adenocarcinoma pulmonariu stadiu I.L'adenocarcinomi mostranu profili metabolomici unichi, mentri i noduli benigni è l'individui sani anu una alta similarità in i profili metabolomici.In u gruppu di scuperta (n = 306), un inseme di metaboliti 27 hè statu identificatu per diferenze trà i noduli benigni è maligni.L'AUC di u mudellu discriminante in i gruppi di validazione interna (n = 104) è validazione esterna (n = 111) era 0.915 è 0.945, rispettivamente.L'analisi di u percorsu hà revelatu metaboliti glicolitici aumentati assuciati à una diminuzione di triptofanu in u serum di adenocarcinoma pulmonare cumparatu cù noduli benigni è cuntrolli sani, è hà suggeritu chì l'assunzione di triptofanu prumove a glicolisi in e cellule di cancro di pulmone.U nostru studiu mette in risaltu u valore di i biomarcatori di metaboliti serum in a valutazione di u risicu di noduli pulmonari rilevati da CT.
A diagnosi precoce hè critica per migliurà i tassi di sopravvivenza per i malati di cancru.I risultati di u Pruvamentu Naziunale di Screening di Cancer di Pulmone di i Stati Uniti (NLST) è di u Studiu Europeu NELSON anu dimustratu chì u screening cù tomografia computerizzata di dosi bassu (LDCT) pò riduce significativamente a mortalità di u cancer di u pulmone in i gruppi à risicu altu1,2,3.Siccomu l'usu generalizatu di LDCT per u screening di u cancer di pulmuniu, l'incidenza di scuperte radiografiche incidentali di noduli pulmonari asimptomatichi hà cuntinuatu à aumentà 4 .I noduli pulmonari sò definiti cum'è opacità focali finu à 3 cm di diametru 5 .Facemu difficultà à valutà a probabilità di malignità è di trattà cù u gran numaru di noduli pulmonari rilevati incidentalmente nantu à LDCT.Limitazioni di CT pò purtà à esami di seguitu frequenti è risultati falsi pusitivi, chì portanu à intervenzioni innecessarii è overtreatment6.Dunque, ci hè bisognu di sviluppà biomarcatori affidabili è utili per identificà currettamente u cancer di pulmone in i primi stadi è differenzià a maiò parte di i noduli benigni à a deteczione iniziale 7 .
L'analisi moleculare cumpleta di u sangue (serum, plasma, cellule mononucleari di sangue perifericu), cumprese a genomica, a proteomica o a metilazione di l'ADN8,9,10, hà purtatu à un interessu crescente in a scuperta di biomarcatori diagnostichi per u cancer di pulmone.Intantu, l'avvicinamenti di metabolomica misuranu i prudutti finali cellulari chì sò influenzati da l'azzioni endogene è esogeni è sò dunque applicati per predichendu l'iniziu è u risultatu di a malatia.A cromatografia liquida-spettrometria di massa in tandem (LC-MS) hè un metudu largamente utilizatu per i studii di metabolomica per via di a so alta sensibilità è di una larga gamma dinamica, chì ponu copre metaboliti cù diverse proprietà fisicochimiche11,12,13.Ancu se l'analisi metabolomica glubale di plasma / serum hè stata aduprata per identificà i biomarcatori assuciati à u diagnosticu di u cancer di pulmone14,15,16,17 è l'efficacità di u trattamentu, i classificatori di metaboliti di serum 18 per distingue trà i noduli pulmonari benigni è maligni restanu assai studiati.- ricerca massiva.
L'adenocarcinoma è u carcinoma squamous cell sò i dui sottutipi principali di u cancer pulmonu non-small cell (NSCLC).Diversi testi di screening CT indicanu chì l'adenocarcinoma hè u tipu histologicu più cumuni di cancru di pulmone1,19,20,21.In stu studiu, avemu usatu cromatografia liquida ultra-prestazioni-spettrometria di massa di alta risoluzione (UPLC-HRMS) per realizà analisi metabolomica nantu à un totale di 695 campioni di serum, cumprese cuntrolli sani, noduli pulmonari benigni è CT-detected ≤3 cm.Screening per l'adenocarcinoma pulmonu di stadiu I.Avemu identificatu un pannellu di metaboliti di serum chì distingue l'adenocarcinoma pulmonare da i noduli benigni è i cuntrolli sani.L'analisi di l'arricchimentu di a via hà revelatu chì u triptofanu anormale è u metabolismu di glucose sò alterazioni cumuni in l'adenocarcinoma pulmonare cumparatu cù noduli benigni è cuntrolli sani.Infine, avemu stabilitu è validatu un classificatore metabolicu di serum cun alta specificità è sensibilità per distingue trà i noduli pulmonari maligni è benigni rilevati da LDCT, chì ponu aiutà à u diagnosticu differenziale precoce è a valutazione di risicu.
In u studiu attuale, i campioni di serum di sessu è di età sò stati raccolti retrospettivamente da 174 cuntrolli sani, 292 pazienti cù noduli pulmonari benigni, è 229 pazienti cù adenocarcinoma pulmonariu stadiu I.E caratteristiche demografiche di i sughjetti 695 sò mostrate in a Tabella Supplementaria 1.
Cum'è mostra in a Figura 1a, un totale di 480 campioni di serum, cumprese 174 cuntrolli sani (HC), 170 noduli benigni (BN), è 136 campioni di adenocarcinoma pulmonare (LA) di stadiu I, sò stati raccolti in u Sun Yat-sen University Cancer Center.Cohorte di scuperta per un prufilu metabolomicu senza mira cù cromatografia liquida ultra-performance-spettrometria di massa ad alta risoluzione (UPLC-HRMS).Cum'è mostratu in a Figura Supplementaria 1, i metaboliti differenziali trà LA è HC, LA è BN sò stati identificati per stabilisce un mudellu di classificazione è scopre ulteriormente l'analisi di via differenziale.104 campioni raccolti da Sun Yat-sen University Cancer Center è 111 campioni raccolti da altri dui ospedali sò stati sottumessi à validazione interna è esterna, rispettivamente.
Una pupulazione di studiu in a cohorte di scuperta chì hè stata sottumessa à l'analisi metabolomica di serum globale utilizendu cromatografia liquida ultra-performance-spettrometria di massa à alta risoluzione (UPLC-HRMS).b Analisi discriminante parziale di minimi quadrati (PLS-DA) di u metaboloma tutale di 480 campioni di serum da a coorte di studiu, cumpresi cuntrolli sani (HC, n = 174), noduli benigni (BN, n = 170), è adenocarcinoma pulmonariu di stadiu I. (Los Angeles, n = 136).+ ESI, modalità di ionizzazione elettrospray positiva, -ESI, modalità di ionizzazione elettrospray negativa.c–e Metaboliti cù abbundanza significativamente sfarente in dui gruppi dati (test di classificazione firmata Wilcoxon à dui coda, valore p ajustatu di a rata di scuperta falsa, FDR <0.05) sò mostrati in rossu (cambiamentu di volta> 1.2) è blu (cambiamentu di volte <0.83) .) mostratu nantu à u graficu di u vulcano.f Mappa di calore di clustering gerarchicu chì mostra differenze significative in u numeru di metaboliti annotati trà LA è BN.I dati surghjenti sò furniti in forma di schedarii di dati fonte.
U metaboloma di serum totale di 174 HC, 170 BN è 136 LA in u gruppu di scuperta hè statu analizatu cù l'analisi UPLC-HRMS.Mostremu prima chì i campioni di cuntrollu di qualità (QC) raggruppanu strettamente in u centru di un mudellu di analisi di cumpunenti principali (PCA) senza supervisione, cunfirmendu a stabilità di u rendiment di u studiu attuale (Figura Supplementaria 2).
Cum'è mostratu in l'analisi parziale di i minimi quadrati-discriminanti (PLS-DA) in a Figura 1 b, avemu trovu chì ci era differenzi chjaru trà LA è BN, LA è HC in i modi di ionizazione elettrospray pusitivu (+ESI) è negativu (-ESI). .isolatu.Tuttavia, ùn sò micca stati trovati differenzi significativi trà BN è HC in cundizioni + ESI è -ESI.
Avemu trovu 382 caratteristiche differenziali trà LA è HC, 231 caratteristiche differenziali trà LA è BN, è 95 caratteristiche differenziali trà BN è HC (Wilcoxon signed rank test, FDR <0.05 and multiple change> 1.2 or <0.83) (Figura .1c-e) )..I picchi sò stati ulteriormente annotati (Dati Supplementari 3) contr'à una basa di dati (biblioteca mzCloud/HMDB/Chemspider) per valore m / z, tempu di ritenzione è ricerca di spettru di massa di frammentazione (dettagli descritti in a sezione Methods) 22 .Infine, 33 è 38 metaboliti annotati cù differenze significative in abbundanza sò stati identificati per LA versus BN (Figura 1f è Tabella Supplementaria 2) è LA versus HC (Figura Supplementaria 3 è Tabella Supplementaria 2), rispettivamente.In cuntrastu, solu 3 metaboliti cù differenze significative in abbundanza sò stati identificati in BN è HC (Tabella Supplementaria 2), in cunfurmità cù a sovrapposizione trà BN è HC in PLS-DA.Questi metaboliti differenziali coprenu una larga gamma di biochimichi (Figura supplementaria 4).Inseme, sti risultati dimustranu cambiamenti significativi in u metaboloma di u serum chì riflettenu a trasfurmazioni maligna di u cancer di pulmone in u stadiu iniziale cumparatu cù i noduli pulmonari benigni o sughjetti sani.Intantu, a similitudine di u metaboloma di serum di BN è HC suggerisce chì i noduli pulmonari benigni ponu sparte parechje caratteristiche biologiche cù individui sani.Siccomu chì e mutazioni di u genu di u receptore di u fattore di crescita epidermale (EGFR) sò cumuni in l'adenocarcinoma di u pulmone subtipu 23, avemu cercatu di determinà l'impattu di e mutazioni di u mutore nantu à u metaboloma di serum.Dopu avemu analizatu u prufilu metabolomicu generale di 72 casi cù u statutu EGFR in u gruppu di adenocarcinoma pulmonar.Curiosamente, avemu trovu profili paragunabili trà i pazienti mutanti EGFR (n = 41) è i pazienti EGFR salvaticu (n = 31) in l'analisi PCA (Figura Supplementaria 5a).Tuttavia, avemu identificatu 7 metaboliti chì l'abbundanza hè stata significativamente alterata in i pazienti cun mutazione EGFR cumparatu cù i pazienti cù EGFR di tipu salvaticu (test t, p <0.05 è cambiamentu di volte> 1.2 o <0.83) (Figura Supplementaria 5b).A maiò parte di sti metaboliti (5 fora di 7) sò acilcarnitines, chì ghjucanu un rolu impurtante in i camini di oxidazione di l'acidu grassu.
Cum'è illustratu in u flussu di travagliu mostratu in a Figura 2 a, i biomarcatori per a classificazione di noduli sò stati ottenuti utilizendu operatori di shrinkage minimu assolutu è selezzione basatu nantu à 33 metaboliti differenziali identificati in LA (n = 136) è BN (n = 170).A megliu cumminazione di variàbili (LASSO) - mudellu di regressione logistica binaria.A validazione incruciata di dece volte hè stata utilizata per pruvà l'affidabilità di u mudellu.A selezzione di variabile è a regularizazione di i paràmetri sò aghjustate da una penalità di maximizazione di probabilità cù u paràmetru λ24.L'analisi metabolomica glubale hè stata ulteriormente realizata indipindente in i gruppi di validazione interna (n = 104) è validazione esterna (n = 111) per pruvà a prestazione di classificazione di u mudellu discriminante.In u risultatu, i metaboliti 27 in u settore di scuperta sò stati identificati cum'è u megliu mudellu discriminante cù u più grande valore AUC mediu (Fig. 2b), trà quale 9 anu aumentatu l'attività è 18 diminuite l'attività in LA cumparatu cù BN (Fig. 2c).
U flussu di travagliu per a custruzzione di un classificatore di noduli pulmonari, cumprese a selezzione di u megliu pannellu di metaboliti di serum in u settore di scuperta utilizendu un mudellu di regressione logistica binaria per via di validazione incruciata di deci volte è evaluendu u rendiment predittivu in setti di validazione interna è esterna.b Statistiche di validazione incruciata di u mudellu di regressione LASSO per a selezzione di biomarcatori metabolichi.I numeri dati sopra rapprisentanu u numeru mediu di biomarcatori selezziunati à un datu λ.A linea rossa puntinata rapprisenta u valore mediu AUC à u lambda currispundente.E barre d'errore grise rapprisentanu i valori AUC minimi è massimi.A linea punteggiata indica u megliu mudellu cù i 27 biomarcatori selezziunati.AUC, area sottu a curva di a caratteristica operativa di u receptore (ROC).c Fold cambiamenti di 27 metaboliti selezziunati in u gruppu LA cumparatu cù u gruppu BN in u gruppu di scuperta.Colonna rossa - attivazione.A colonna blu hè una decadenza.d-f Curve di caratteristiche di u funziunamentu di u ricevitore (ROC) chì mostranu u putere di u mudellu discriminante basatu annantu à 27 cumminazzioni di metaboliti in i setti di scuperta, interna è esterna di validazione.I dati surghjenti sò furniti in forma di schedarii di dati fonte.
Un mudellu di predizione hè statu creatu basatu annantu à i coefficienti di regressione ponderati di questi metaboliti 27 (Tabella Supplementaria 3).L'analisi ROC basatu annantu à questi metaboliti 27 cedeu una zona sottu u valore di a curva (AUC) di 0.933, a sensibilità di u gruppu di scuperta era 0.868, è a specificità era 0.859 (Fig. 2d).Intantu, trà i 38 metaboliti differenziali annotati trà LA è HC, un inseme di metaboliti 16 hà ottenutu un AUC di 0.902 cù una sensibilità di 0.801 è specificità di 0.856 in discriminazione di LA da HC (Figura Supplementaria 6a-c).I valori di AUC basati nantu à diversi soglie di cambiamentu di piegatura per i metaboliti differenziali sò stati ancu paragunati.Avemu trovu chì u mudellu di classificazione hà fattu u megliu in a discriminazione trà LA è BN (HC) quandu u livellu di cambiamentu di piega hè statu stabilitu à 1.2 versus 1.5 o 2.0 (Figura supplementaria 7a, b).U mudellu di classificazione, basatu annantu à i gruppi di metaboliti 27, hè statu più validatu in cohorts interni è esterni.L'AUC era 0.915 (sensibilità 0.867, specificità 0.811) per validazione interna è 0.945 (sensibilità 0.810, specificità 0.979) per validazione esterna (Fig. 2e, f).Per valutà l'efficienza interlaboratori, 40 campioni da a cohorte esterna sò stati analizati in un laboratoriu esternu cum'è deskrittu in a sezione Metudu.A precisione di classificazione hà righjuntu un AUC di 0.925 (Figura supplementaria 8).Perchè u carcinoma pulmonu squamous cell (LUSC) hè u sicondu subtipu più cumuni di cancru pulmonu non-small cell (NSCLC) dopu l'adenocarcinoma pulmonar (LUAD), avemu ancu pruvatu l'utilità potenziale validata di profili metabolichi.BN è 16 casi di LUSC.L'AUC di discriminazione trà LUSC è BN era 0.776 (Figura Supplementaria 9), chì indica una capacità più povera paragunata à a discriminazione trà LUAD è BN.
I studii anu dimustratu chì a dimensione di noduli nantu à l'imaghjini CT hè correlata positivamente cù a probabilità di malignità è resta un determinante maiò di u trattamentu di noduli25,26,27.L'analisi di dati da a grande cohorte di u studiu di screening NELSON dimustrava chì u risicu di malignità in i sughjetti cù nodi <5 mm era ancu simili à quellu in i sughjetti senza nodi 28 .Per quessa, a dimensione minima chì esige un monitoraghju CT regularmente hè 5 mm, cum'è cunsigliatu da a Società Toracica Britannica (BTS), è 6 mm, cum'è ricumandatu da a Società Fleischner 29 .In ogni casu, i noduli più grande di 6 mm è senza caratteristiche benigni evidenti, chjamati noduli pulmonari indeterminati (IPN), restanu una sfida maiò in a valutazione è a gestione in a pratica clinica30,31.Dopu avemu esaminatu se a dimensione di i noduli hà influenzatu e firme metabolomiche utilizendu campioni cumulati da e scuperte è e coorti di validazione interna.Fighjendu nantu à 27 biomarcatori validati, avemu prima paragunatu i profili PCA di metabolomi HC è BN sub-6 mm.Avemu trovu chì a maiò parte di i punti di dati per HC è BN si superponu, dimustrendu chì i livelli di metaboliti di serum eranu simili in i dui gruppi (Fig. 3a).I mape di caratteristiche in diverse varieghja di grandezza sò stati cunservati in BN è LA (Fig. 3b, c), mentri una separazione hè stata osservata trà i noduli maligni è benigni in u 6-20 mm (Fig. 3d).Questa cohorte hà avutu un AUC di 0.927, specificità di 0.868, è sensibilità di 0.820 per predichendu a malignità di noduli di 6 à 20 mm (Fig. 3e, f).I nostri risultati mostranu chì u classificatore pò catturà cambiamenti metabolichi causati da a trasfurmazioni maligni precoci, indipendentemente da a dimensione di i noduli.
ad Comparazione di profili PCA trà gruppi specifichi basatu annantu à un classificatore metabolicu di 27 metaboliti.CC è BN < 6 mm.b BN < 6 mm versus BN 6-20 mm.in LA 6-20 mm versus LA 20-30 mm.g BN 6-20 mm è LA 6-20 mm.GC, n = 174;BN < 6 mm, n = 153;BN 6-20 mm, n = 91;LA 6-20 mm, n = 89;LA 20-30 mm, n = 77. e Curva di a caratteristica operativa di u receptore (ROC) chì mostra u rendiment di u mudellu discriminante per i noduli 6-20 mm.f I valori di probabilità sò stati calculati nantu à u mudellu di regressione logistica per i noduli chì misuranu 6-20 mm.A linea punteggiata grisa rapprisenta u valore di cutoff ottimali (0,455).I numeri sopra rapprisentanu u percentuale di casi prughjettati per Los Angeles.Aduprate un test t di Studente à duie code.PCA, analisi di cumpunenti principali.AUC area sottu a curva.I dati surghjenti sò furniti in forma di schedarii di dati fonte.
Quattru campioni (età 44-61 anni) cù dimensioni simili di noduli pulmonari (7-9 mm) sò stati scelti più per illustrà u funziunamentu di u mudellu di predizione di malignità pruposta (Fig. 4a, b).À u screening iniziale, u Casu 1 si prisentava cum'è un nodulu solidu cù calcificazione, una caratteristica assuciata à a benignità, mentri u Casu 2 presentava cum'è un nodulu parzialmente solidu indeterminatu senza caratteristiche benigni evidenti.Trè rounds di seguitu CT scans dimustranu chì questi casi sò stati stabile nantu à un periudu di 4 anni è sò dunque cunsiderati noduli benigni (Fig. 4a).In cunfrontu cù l'evaluazione clinica di scans CT seriali, l'analisi di metabolite di serum à un colpu cù u mudellu di classificatore attuale identificanu rapidamente è currettamente sti noduli benigni basati nantu à limitazioni probabilistiche (Table 1).A figura 4b in casu 3 mostra un nodulu cù signali di retrazione pleurale, chì hè più spessu assuciatu cù malignità32.Casu 4 prisentatu cum'è un nodulu parzialmente solidu indeterminatu senza evidenza di una causa benigna.Tutti questi casi sò stati previsti cum'è maligni secondu u mudellu di classificatore (Table 1).A valutazione di l'adenocarcinoma pulmonale hè statu dimustratu da l'esame histopatologicu dopu a cirurgia di resection pulmonar (Fig. 4b).Per u settore di validazione esterna, u classificatore metabolicu hà preditu accuratamente dui casi di noduli pulmonari indeterminati più grande di 6 mm (Figura Supplementaria 10).
L'imaghjini CT di a finestra assiale di i pulmoni di dui casi di noduli benigni.In u casu 1, CT scan dopu à 4 anni dimustrava un nodulu solidu stabile di 7 mm cù calcificazione in u lòbulu inferiore dirittu.In u casu 2, CT scan dopu à 5 anni palesa un nodulu stabile, parzialmente solidu cù un diametru di 7 mm in u lòbulu superiore dirittu.b Axial window CT images di i pulmoni è studii patologichi currispundenti di dui casi di adenocarcinoma stadiu I prima di resection pulmonar.U casu 3 hà revelatu un nodulu cù un diametru di 8 mm in u lòbulu superiore drittu cù retraction pleurale.U casu 4 hà revelatu un nodulu di vetru macinatu parzialmente solidu chì misura 9 mm in u lòbulu superiore manca.Coloration à l'hématoxyline et à l'éosine (H&E) du tissu pulmonaire réséqué (barre d'échelle = 50 μm) démontrant le modèle de croissance acineuse de l'adénocarcinome pulmonaire.Le frecce indicano noduli rilevati in immagini CT.L'imaghjini H&E sò imaghjini rapprisentanti di più (> 3) campi microscòpichi esaminati da u patologu.
Inseme, i nostri risultati dimustranu u valore potenziale di i biomarcatori di i metaboliti di serum in u diagnosticu differenziale di i noduli pulmonari, chì ponu esse sfide in a valutazione di u screening CT.
Basatu nantu à un pannellu di metabolite differenziale validatu, avemu cercatu di identificà i correlati biologichi di i cambiamenti metabolichi maiò.L'analisi di arricchimentu di via KEGG da MetaboAnalyst identificò 6 percorsi cumuni significativamente alterati trà i dui gruppi dati (LA vs. HC è LA vs. BN, p ≤ 0.001 ajustatu, effettu> 0.01).Sti cambiamenti sò carattarizati da disturbi in u metabolismu di piruvate, u metabolismu di u triptofanu, u metabolismu di niacina è nicotinamide, glicolisi, u ciculu TCA è u metabolismu di purine (Fig. 5a).Dopu avemu realizatu ancu una metabolomica mirata per verificà i cambiamenti maiò utilizendu quantificazione assoluta.Determinazione di metaboliti cumuni in percorsi cumunimenti alterati per spettrometria di massa triple quadrupole (QQQ) utilizendu standard di metaboliti autentichi.E caratteristiche demografiche di l'esempiu di destinazione di studiu di metabolomica sò inclusi in a Tabella Supplementaria 4. In cunfurmità cù i nostri risultati di metabolomica glubale, l'analisi quantitativa cunfirmava chì l'ipoxantina è a xantina, u piruvate è u lactate anu aumentatu in LA cumparatu cù BN è HC (Fig. 5b, c, p <0,05).In ogni casu, ùn sò micca stati differenzi significati in questi metaboliti trà BN è HC.
Analisi di arricchimentu di via KEGG di metaboliti significativamente differenti in u gruppu LA cumparatu cù i gruppi BN è HC.Un Globaltest à dui coda hè stata utilizata, è i valori p sò stati aghjustati cù u metudu Holm-Bonferroni (p ≤ 0.001 ajustatu è dimensione di l'effettu> 0.01).b–d Violin plots chì mostranu i livelli di ipoxantina, xantina, lactate, piruvate è triptofanu in u sieru HC, BN è LA determinati da LC-MS/MS (n = 70 per gruppu).I linii punti bianchi è neri indicanu a mediana è u quartile, rispettivamente.e Trama di Violin chì mostra l'espressione di mRNA Log2TPM (trascrizioni per milione) normalizzata di SLC7A5 è QPRT in adenocarcinoma pulmonare (n = 513) cumparatu cù u tissutu pulmonu normale (n = 59) in u dataset LUAD-TCGA.A scatula bianca rapprisenta a gamma interquartile, a linea negra horizontale in u centru rapprisenta a mediana, è a linea negra verticale chì si estende da a casella rapprisenta l'intervallu di cunfidenza di 95% (CI).f Trama di correlazione di Pearson di l'espressione SLC7A5 è GAPDH in l'adenocarcinoma pulmonar (n = 513) è u tissutu pulmonu normale (n = 59) in u dataset TCGA.L'area grisa rapprisenta u 95% CI.r, coefficient di correlazione di Pearson.g Livelli di triptofanu cellulari normalizzati in cellule A549 trasfettate cù un cuntrollu shRNA non specificu (NC) è shSLC7A5 (Sh1, Sh2) determinatu da LC-MS / MS.L'analisi statistiche di cinque campioni biologicamente indipendenti in ogni gruppu hè presentata.h Livelli cellulari di NADt (NAD totale, cumprese NAD + è NADH) in cellule A549 (NC) è cellule SLC7A5 knockdown A549 (Sh1, Sh2).L'analisi statistiche di trè campioni biologicamente indipendenti in ogni gruppu hè presentata.i L'attività glicolitica di e cellule A549 prima è dopu l'abbattimentu di SLC7A5 hè stata misurata da a rata di acidificazione extracellulare (ECAR) (n = 4 campioni biologicamente indipendenti per gruppu).2-DG,2-desossi-D-glucose.A prova t di Studente à duie code hè stata utilizata in (b–h).In (g–i), e barre d'errore rapprisentanu a media ± SD, ogni esperimentu hè statu fattu trè volte indipindente è i risultati eranu simili.I dati surghjenti sò furniti in forma di schedarii di dati fonte.
In cunsiderà l'impattu significativu di u metabolismu di triptofanu alteratu in u gruppu LA, avemu ancu valutatu i livelli di triptofanu serum in i gruppi HC, BN è LA cù QQQ.Avemu trovu chì u triptofanu di serum hè statu ridutta in LA cumparatu cù HC o BN (p <0.001, Figura 5d), chì hè coherente cù scuperte precedenti chì i livelli di triptofanu circulante sò più bassi in i malati cù cancru di pulmone cà in cuntrolli sani da u gruppu di cuntrollu33,34. ,35.Un altru studiu utilizendu u tracciante PET / CT 11C-methyl-L-tryptophan hà truvatu chì u tempu di ritenzione di u signale di triptofanu in u tessulu di u cancer di u pulmone era significativamente aumentatu cumparatu cù lesioni benigni o tissutu normale36.Ipotisemu chì a diminuzione di u triptofanu in u serum LA pò riflette l'assunzione di triptofanu attivu da e cellule di cancro di pulmone.
Hè cunnisciutu ancu chì u pruduttu finali di a via di kynurenine di u catabolismu di triptofanu hè NAD + 37,38, chì hè un sustrato impurtante per a reazione di glyceraldehyde-3-phosphate cù 1,3-bisphosphoglycerate in glicolisi39.Mentre i studii precedenti anu focu annantu à u rolu di u catabolismu di u triptofanu in a regulazione immune, avemu cercatu di elucidare l'interazione trà a disregulazione di u triptofanu è i viaghji glicolitici osservati in u studiu attuale.A famiglia di trasportatore solutu 7 membru 5 (SLC7A5) hè cunnisciutu per esse un trasportatore di triptofanu43,44,45.A fosforibosiltransferasi di l'acidu quinolinicu (QPRT) hè una enzima situata à a valle di a via di chinurenina chì cunverte l'acidu quinolinicu in NAMN46.L'ispezione di u dataset LUAD TCGA hà revelatu chì SLC7A5 è QPRT sò stati significativamente upregulated in u tissue tumorale cumparatu cù u tissutu normale (Fig. 5e).Questu aumentu hè statu osservatu in i stadi I è II è ancu in i stadi III è IV di l'adenocarcinoma pulmonariu (Figura Supplementaria 11), chì indicanu disturbi precoci in u metabolismu di u triptofanu assuciatu à a tumorigenesi.
Inoltre, u dataset LUAD-TCGA hà dimustratu una correlazione positiva trà l'espressione di SLC7A5 è GAPDH mRNA in campioni di pazienti di cancro (r = 0.45, p = 1.55E-26, Figura 5f).In cuntrastu, nisuna correlazione significativa hè stata trovata trà tali signatures di geni in u tessulu pulmonariu normale (r = 0.25, p = 0.06, Figura 5f).L'abbattimentu di SLC7A5 (Figura Supplementaria 12) in e cellule A549 hà riduciutu significativamente i livelli di triptofanu cellulare è NAD (H) (Figura 5g, h), risultante in attività glicolitica attenuata misurata da a rata di acidificazione extracellulare (ECAR) (Figura 1).5i).Cusì, basatu annantu à i cambiamenti metabolichi in u serum è a rilevazione in vitro, ipotisemu chì u metabolismu di u triptofanu pò pruduce NAD + per via di a kynurenine è ghjucà un rolu impurtante in a promozione di a glicolisi in u cancer di pulmone.
I studii anu dimustratu chì un gran numaru di noduli pulmonari indeterminati rilevati da LDCT pò purtà à a necessità di teste supplementari, cum'è PET-CT, biòpsia pulmonale, è overtreatment per via di un diagnosticu falsu pusitivu di malignità.31 As mostra in Figura 6, u nostru studiu hà identificatu un pannellu di metaboliti di serum cù un valore diagnosticu potenziale chì pò migliurà a stratificazione di risicu è a gestione successiva di i noduli pulmonari rilevati da CT.
I noduli pulmonari sò valutati cù una tomografia computerizzata di dosi bassu (LDCT) cù funzioni di imaging suggerenti di cause benigni o maligni.U risultatu incertu di i noduli pò purtà à frequenti visite di seguitu, intervenzioni innecessarii è overtreatment.L'inclusione di classificatori metabolichi serum cun valore diagnosticu pò migliurà a valutazione di risichi è a gestione successiva di i noduli pulmonari.Tomografia PET à emissione di positroni.
Dati da u studiu NLST di i Stati Uniti è u studiu europeu NELSON suggerenu chì u screening di gruppi à altu risicu cù a tomografia computerizzata di dosi bassu (LDCT) pò riduce a mortalità di u cancer di pulmone1,3.Tuttavia, a valutazione di u risicu è a gestione clinica successiva di un gran numaru di noduli pulmonari incidentali rilevati da LDCT restanu a più sfida.U scopu principale hè di ottimisà a classificazione curretta di i protokolli basati in LDCT esistenti incorporendu biomarcatori affidabili.
Certi biomarcatori moleculari, cum'è i metaboliti di u sangue, sò stati identificati paragunendu u cancer di pulmone cù cuntrolli sani15,17.In u studiu attuale, avemu focu annantu à l'applicazione di l'analisi metabolomica di serum per distingue trà i noduli pulmonari benigni è maligni rilevati incidentalmente da LDCT.Avemu paragunatu u metaboloma di u serum glubale di cuntrollu sanu (HC), noduli pulmonari benigni (BN), è campioni di adenocarcinoma pulmonariu di stadiu I (LA) utilizendu l'analisi UPLC-HRMS.Avemu trovu chì HC è BN avianu profili metabolichi simili, mentri LA hà mostratu cambiamenti significativi cumparatu cù HC è BN.Avemu identificatu dui gruppi di metaboliti di serum chì differenzianu LA da HC è BN.
L'attuale schema d'identificazione basata in LDCT per i noduli benigni è maligni hè principalmente basatu annantu à a dimensione, a densità, a morfologia è a rata di crescita di i noduli in u tempu30.Studi precedenti anu dimustratu chì a dimensione di i noduli hè strettamente ligata à a probabilità di cancru di pulmone.Ancu in i malati d'altu risicu, u risicu di malignità in i nodi <6 mm hè <1%.U risicu di malignità per i noduli di 6 à 20 mm varieghja da 8% à 64%30.Per quessa, a Società Fleischner raccomanda un diametru di cutoff di 6 mm per u seguimentu di rutina CT.29 In ogni casu, a valutazione di risichi è a gestione di i noduli pulmonari indeterminati (IPN) più grande di 6 mm ùn sò micca stati adeguatamente realizati 31 .A gestione attuale di a malatia di u cori congenitale hè generalmente basatu annantu à l'attesa attenta cù un monitoraghju CT frequente.
Basatu nantu à u metaboloma validatu, avemu dimustratu per a prima volta a sovrapposizione di signature metabolomica trà individui sani è noduli benigni <6 mm.A similitudine biologica hè coherente cù i scuperti CT precedenti chì u risicu di malignità per i noduli <6 mm hè cusì bassu cum'è per i sughjetti senza noduli. similarità in i profili metabolomici, chì suggerenu chì a definizione funziunale di l'etiologia benigna hè coherente indipendentemente da a dimensione di i noduli.Cusì, i pannelli di metaboliti di serum di diagnostichi muderni ponu furnisce un esame unicu cum'è una prova di regula quandu i noduli sò inizialmente rilevati in CT è potenzialmente riducenu u monitoraghju seriale.À u listessu tempu, u listessu pannellu di biomarcatori metabolichi distingueva i noduli maligni ≥6 mm in grandezza da i noduli benigni è furnia previsioni precise per IPN di dimensioni simili è caratteristiche morfologiche ambigue nantu à l'imaghjini CT.Stu classificatore di u metabolismu di u serum hà fattu bè in predichendu a malignità di noduli ≥6 mm cù una AUC di 0,927.Inseme, i nostri risultati indicanu chì e signatures metabolomiche di u serum unichi ponu riflette specificamente i cambiamenti metabolichi indotti da tumori precoci è avè un valore potenziale cum'è predittori di risicu, indipendentemente da a dimensione di i noduli.
In particulare, l'adenocarcinoma pulmonu (LUAD) è u carcinoma squamous cell (LUSC) sò i principali tipi di cancer pulmonar non-small cell (NSCLC).Siccomu chì LUSC hè assai assuciatu cù l'usu di tabacco47 è LUAD hè l'istologia più cumuna di i noduli pulmonari incidentali rilevati in u screening CT48, u nostru mudellu di classificatore hè statu specificamente custruitu per campioni di adenocarcinoma di stadiu I.Wang è i culleghi anu ancu focu annantu à LUAD è identificanu nove signatures di lipidi utilizendu lipidomica per distingue u cancer di pulmone in u stadiu iniziale da l'individui sani17.Avemu pruvatu u mudellu di classificatore attuale nantu à 16 casi di stadi I LUSC è 74 noduli benigni è osservatu una bassa precisione di prediczione di LUSC (AUC 0,776), suggerendu chì LUAD è LUSC pò avè a so propria firma metabolomica.Infatti, LUAD è LUSC sò stati dimustrati per esse diffirenti in l'etiologia, l'origine biologica è l'aberrazioni genetiche49.Per quessa, altri tipi di istologia duveranu esse inclusi in mudelli di furmazione per a deteczione di u cancru di pulmone basatu in a pupulazione in i prugrammi di screening.
Quì, avemu identificatu i sei percorsi alterati più frequenti in l'adenocarcinoma pulmonare cumparatu cù cuntrolli sani è noduli benigni.Xanthine è hypoxanthine sò metaboliti cumuni di a via metabolica purina.In cunfurmità cù i nostri risultati, l'intermedii assuciati cù u metabolismu di purine anu aumentatu significativamente in u serum o tissuti di i malati cù adenocarcinoma pulmonare cumparatu cù cuntrolli sani o pazienti in u stadiu preinvasivu15,50.I livelli elevati di xantina è ipoxantina di serum ponu riflette l'anabolismu necessariu da e cellule cancerose chì proliferanu rapidamente.A disregulazione di u metabolismu di u glucose hè un segnu ben cunnisciutu di u metabolismu di u cancer51.Quì, avemu osservatu un aumentu significativu di piruvate è lactate in u gruppu LA cumparatu cù u gruppu HC è BN, chì hè coherente cù i rapporti precedenti di anomalie di a via glicolitica in i profili di metaboloma di serum di i malati di cancro di pulmone non-small cell (NSCLC) è cuntrolli sani.i risultati sò cunsistenti52,53.
Impurtante, avemu osservatu una correlazione inversa trà u metabolismu di u piruvate è u triptofanu in u serum di l'adenocarcinomas pulmonari.I livelli di triptofanu di serum sò stati ridotti in u gruppu LA cumparatu cù u gruppu HC o BN.Curiosamente, un studiu precedente di grande scala chì utilizeghja una cohorte prospectiva hà truvatu chì i livelli bassi di triptofanu circulante sò assuciati cù un risicu aumentatu di cancru di pulmone 54 .U triptofanu hè un aminoacidu essenziale chì uttene sanu da l'alimentariu.Cuncludemu chì a deplezione di u triptofanu di u serum in l'adenocarcinoma di u pulmone pò riflette una deplezione rapida di stu metabolite.Hè ben cunnisciutu chì u pruduttu finale di u catabolismu di triptofanu via a via di kynurenine hè a fonte di sintesi de novo NAD +.Perchè NAD + hè pruduciutu principarmenti attraversu a via di salvezza, l'impurtanza di NAD + in u metabolismu di u triptofanu in a salute è a malatia resta da esse determinata46.A nostra analisi di a basa di dati TCGA hà dimustratu chì l'espressione di u trasportatore di solute di u trasportatore di triptofanu 7A5 (SLC7A5) hè stata significativamente aumentata in l'adenocarcinoma pulmonare cumparatu cù i cuntrolli normali è era correlata positivamente cù l'espressione di l'enzima glicoliticu GAPDH.Studi precedenti anu cuncentratu principarmenti nantu à u rolu di u catabolismu di triptofanu in a suppressione di a risposta immune antitumorale40,41,42.Quì avemu dimustratu chì l'inibizione di l'assunzione di triptofanu da u knockdown di SLC7A5 in e cellule di cancro di u pulmone risulta in una diminuzione successiva di i livelli di NAD cellulare è una attenuazione concomitante di l'attività glicolitica.In riassuntu, u nostru studiu furnisce una basa biologica per i cambiamenti in u metabolismu di u serum assuciatu à a trasformazione maligna di l'adenocarcinoma pulmonar.
E mutazioni EGFR sò i mutazioni di u driver più cumuni in i malati cù NSCLC.In u nostru studiu, truvamu chì i malati cù a mutazione EGFR (n = 41) avianu profili metabolomichi in generale simili à i malati cù EGFR salvaticu (n = 31), ancu s'è truvamu livelli di serum diminuite di certi pazienti mutanti EGFR in pazienti acilcarnitine.A funzione stabilita di l'acylcarnitines hè di trasportà i gruppi acili da u citoplasma in a matrice mitocondriale, chì porta à l'oxidazione di l'acidi grassi per pruduce energia 55 .In cunfurmità cù i nostri scuperti, un studiu recente hà ancu identificatu profili di metaboloma simili trà i tumuri di u mutante EGFR è di u tipu salvaticu EGFR analizendu u metaboloma glubale di 102 campioni di tissuti di adenocarcinoma pulmonare50.Curiosamente, u cuntenutu di acilcarnitina hè statu ancu truvatu in u gruppu mutante EGFR.Dunque, se i cambiamenti in i livelli di acilcarnitina riflettenu i cambiamenti metabolichi indotti da EGFR è i percorsi moleculari sottostanti ponu merità più studiu.
In cunclusione, u nostru studiu stabilisce un classificatore metabolicu di serum per u diagnosticu differenziale di i noduli pulmonari è prupone un flussu di travagliu chì pò ottimisà a valutazione di risichi è facilità a gestione clinica basata nantu à u screening CT scan.
Stu studiu hè statu appruvatu da u Cumitatu Eticu di l'Hospital di Cancer di l'Università di Sun Yat-sen, u Primu Ospedale Affiliatu di l'Università Sun Yat-sen, è u Cumitatu Eticu di l'Hospital di Cancer di l'Università di Zhengzhou.In i gruppi di scuperta è validazione interna, 174 serii da individui sani è 244 serii da noduli benigni sò stati raccolti da individui sottumessi à esami medichi annuali in u Dipartimentu di Controlu è Prevenzione di u Cancer, Sun Yat-sen University Cancer Center, è 166 noduli benigni.serum.L'adenocarcinomi pulmonari di u stadiu I sò stati raccolti da u Sun Yat-sen University Cancer Center.In a cohorte di validazione esterna, ci sò stati 48 casi di noduli benigni, 39 casi di adenocarcinoma di u pulmone di u stadiu I da u Primu Hospital Affiliatu di l'Università Sun Yat-sen, è 24 casi di l'adenocarcinoma di u pulmone di u stadiu I da l'Hospital di Cancer di Zhengzhou.Sun Yat-sen University Cancer Center hà ancu cullucatu 16 casi di stadi I di cancro di pulmone squamous cell per pruvà a capacità diagnostica di u classificatore metabolicu stabilitu (e caratteristiche di i pazienti sò mostrate in a Tabella Supplementaria 5).Campioni da a cohorte di scuperta è a cohorte di validazione interna sò stati cullati trà ghjennaghju 2018 è maghju 2020. Campioni per a cohorte di validazione esterna sò stati raccolti trà l'agostu 2021 è uttrovi 2022. Per minimizzà u preghjudiziu di genere, apprussimatamente uguali numeri di casi maschili è femini sò stati attribuiti à ognunu. cohorte.Squadra di scuperta è Squadra di Revisione Interna.U sessu di i participanti hè statu determinatu basatu annantu à l'autore rapportu.Un accunsentu informatu hè statu ottenutu da tutti i participanti è ùn hè statu furnitu alcuna compensazione.I sughjetti cù noduli benigni eranu quelli chì anu un puntu di scansione CT stabile à 2 à 5 anni à u mumentu di l'analisi, salvu 1 casu da a mostra di validazione esterna, chì hè stata cullata preoperatoriamente è diagnosticata da histopatologia.Cù l'eccezzioni di bronchite crònica.I casi di adenocarcinoma pulmonale sò stati cullati prima di a resezione pulmonaria è cunfirmati da un diagnosticu patologicu.I campioni di sangue di digiunu sò stati raccolti in tubi di separazione di serum senza alcunu anticoagulanti.I campioni di sangue sò stati coagulati per 1 ora à a temperatura di l'ambienti è poi centrifugati à 2851 × g per 10 minuti à 4 ° C per cullà u supernatant di serum.L'aliquote di serum sò stati congelati à -80 ° C finu à l'estrazione di metabolite.U Dipartimentu di Prevenzione di Cancer è Esame Medicu di u Sun Yat-sen University Cancer Center hà cullatu una piscina di serum da 100 donatori sani, cumprese un numeru uguale di omi è donne da 40 à 55 anni.Volumi uguali di ogni mostra di donatore sò stati mischiati, a piscina risultante hè stata aliquotata è almacenata à -80 ° C.A mistura di serum hè stata utilizata com'è materiale di riferimentu per u cuntrollu di qualità è a standardizazione di dati.
U serum di riferimentu è e teste di teste sò stati scongelati è i metaboliti sò stati estratti cù un metudu d'estrazione cumminata (MTBE / metanol / acqua) 56 .In breve, 50 μl di serum sò stati mischiati cù 225 μl di metanolu ghiacciatu è 750 μl di metil tert-butil etere (MTBE) ghiacciatu.Agite a mistura è incubate nantu à u ghjacciu per 1 ora.I campioni sò stati poi mischiati è vortex mischiati cù 188 μl d'acqua MS-grade chì cuntene standard interni (13C-lactate, 13C3-pyruvate, 13C-methionine è 13C6-isoleucine, acquistatu da Cambridge Isotope Laboratories).A mistura hè stata centrifugata à 15,000 × g per 10 min à 4 ° C, è a fase più bassa hè stata trasferita in dui tubi (125 μL ognunu) per l'analisi LC-MS in modi pusitivi è negativi.Infine, a mostra hè stata evaporata à secca in un concentratore di vacuum d'alta velocità.
I metaboliti secchi sò stati ricostituiti in 120 μl di acetonitrile 80%, vortexed per 5 min, è centrifugati à 15.000 × g per 10 min à 4 ° C.I supernatanti sò stati trasferiti in vials di vetru ambra cù microinserti per studii di metabolomica.Analisi di metabolomica senza mira nantu à una piattaforma di cromatografia liquida ultra-prestazioni-spettrometria di massa ad alta risoluzione (UPLC-HRMS).I metaboliti sò stati separati cù un sistema Dionex Ultimate 3000 UPLC è una colonna ACQUITY BEH Amide (2.1 × 100 mm, 1.7 μm, Waters).In modu di ioni pusitivi, e fasi mobili eranu 95% (A) è 50% acetonitrile (B), ognunu cuntene 10 mmol / L acetate ammonium è 0.1% acid formic.In u modu negativu, e fasi mobili A è B cuntenenu 95% è 50% acetonitrile, rispettivamente, e duie fasi cuntenenu 10 mmol / L acetate ammonium, pH = 9. U prugramma di gradiente era cusì: 0-0.5 min, 2% B;0,5-12 min, 2-50% B;12-14 min, 50-98% B;14-16 min, 98% B;16-16.1.min, 98 -2% B;16.1-20 min, 2% B. A colonna hè stata mantinuta à 40 ° C è a mostra à 10 ° C in l'autosampler.U flussu era 0,3 ml / min, u voluminu d'iniezione era 3 μl.Un spettrometru di massa Q-Exactive Orbitrap (Thermo Fisher Scientific) cù una fonte di ionizazione elettrospray (ESI) hè stata operata in modu di scansione cumpleta è accumpagnata cù u modu di monitoraghju ddMS2 per cullà grandi volumi di dati.I paràmetri MS sò stati stabiliti cum'è seguente: voltage spray + 3.8 kV / - 3.2 kV, temperatura capillare 320 ° C, gas shielding 40 arb, gas ausiliari 10 arb, temperatura di riscaldatore di sonda 350 ° C, scanning range 70-1050 m / h, risoluzione.70 000. I dati sò stati acquistati cù Xcalibur 4.1 (Thermo Fisher Scientific).
Per valutà a qualità di dati, i campioni di cuntrollu di qualità (QC) sò stati generati rimuovendu 10 μL aliquots di u supernatante da ogni mostra.Sei iniezioni di mostra di cuntrollu di qualità sò stati analizati à u principiu di a sequenza analitica per valutà a stabilità di u sistema UPLC-MS.I campioni di cuntrollu di qualità sò poi introdutti periodicamente in u batch.Tutti i 11 batchs of serum samples in stu studiu sò stati analizati da LC-MS.Aliquots di una mistura di serum pool da 100 donatori sani sò stati utilizati com'è materiale di riferimentu in rispettivi batch per monitorà u prucessu d'estrazione è aghjustate per effetti batch-to-batch.L'analisi metabolomica senza destinazione di a cohorte di scuperta, a coorte di validazione interna è a coorte di validazione esterna hè stata realizata à u Centru di Metabolomica di l'Università Sun Yat-sen.U laboratoriu esternu di Guangdong University of Technology Analysis and Testing Center hà ancu analizatu 40 campioni da a cohorte esterna per pruvà a prestazione di u mudellu di classificatore.
Dopu l'estrazione è a ricustituzione, a quantificazione assoluta di i metaboliti di serum hè stata misurata utilizendu una cromatografia liquida ultra-alta prestazione-spettrometria di massa in tandem (Agilent 6495 triple quadrupole) cù una fonte di ionizzazione elettrospray (ESI) in modalità di monitoraggio di reazioni multiple (MRM).Una colonna ACQUITY BEH Amide (2,1 × 100 mm, 1,7 μm, Waters) hè stata utilizata per separà metaboliti.A fase mobile consistia di 90% (A) è 5% acetonitrile (B) cù 10 mmol / L acetate d'ammoniu è 0,1% solu di ammonia.U prugramma di gradiente era cusì: 0-1,5 min, 0% B;1,5-6,5 min, 0-15% B;6,5-8 min, 15% B;8-8,5 min, 15%-0% B;8,5-11,5 min, 0% B.A colonna hè stata mantenuta à 40 ° C è a mostra à 10 ° C in l'autosampler.U flussu era 0,3 mL / min è u voluminu d'iniezione era 1 μL.I paràmetri di MS sò stati stabiliti cum'è seguente: voltage capillary ± 3.5 kV, pressione di nebulizzatore 35 psi, flussu di gas di guaina 12 L / min, temperatura di gas di guaina 350 ° C, temperatura di gas di secca 250 ° C, è flussu di gas di secca 14 l / min.I cunversioni MRM di triptofanu, piruvatu, lactate, hypoxanthine è xanthine eranu 205.0-187.9, 87.0-43.4, 89.0-43.3, 135.0-92.3 è 151.0-107.9 rispettivamente.I dati sò stati cullati cù Mass Hunter B.07.00 (Agilent Technologies).Per i campioni di serum, triptofanu, piruvatu, lactate, hypoxanthine è xanthine sò stati quantificati utilizendu curve di calibrazione di suluzione standard di mistura.Per i campioni di cellule, u cuntenutu di triptofanu hè statu normalizatu à u standard internu è a massa di a proteina cellulare.
L'estrazione di piccu (m / z è u tempu di ritenzione (RT)) hè stata realizata cù Compound Discovery 3.1 è TraceFinder 4.0 (Thermo Fisher Scientific).Per eliminà e differenze potenziali trà lotti, ogni piccu caratteristicu di a mostra di prova hè statu divisu da u piccu caratteristicu di u materiale di riferimentu da u stessu batch per ottene l'abbundanza relativa.I deviazioni standard relative di i normi interni prima è dopu à a standardizazione sò mostrati in a Tabella Supplementaria 6. E differenzi trà i dui gruppi sò stati carattarizati da a tarifa di scuperta falsa (FDR <0.05, Wilcoxon signed rank test) è u cambiamentu di volte (> 1.2 o <0.83).I dati MS crudi di e caratteristiche estratte è i dati MS curretti da u serum di riferimentu sò mostrati in Dati Supplementari 1 è Dati Supplementari 2, rispettivamente.L'annotazione di u piccu hè stata realizata nantu à quattru livelli definiti di identificazione, cumpresi metaboliti identificati, composti putativi annotati, classi di cumposti putativamente caratterizati è composti scunnisciuti 22 .Basatu nantu à e ricerche di basa di dati in Compound Discovery 3.1 (mzCloud, HMDB, Chemspider), i cumposti biologichi cù standardi validati MS / MS chì currispondenu o annotazioni di partita esatta in mzCloud (score> 85) o Chemspider sò stati finalmente scelti cum'è intermedi trà u metaboloma differenziale.L'annotazioni di punta per ogni funzione sò incluse in Dati Supplementari 3. MetaboAnalyst 5.0 hè stata utilizata per l'analisi univariate di l'abbundanza di metabolite sum-normalized.MetaboAnalyst 5.0 hà ancu valutatu l'analisi di arricchimentu di via KEGG basatu annantu à metaboliti significativamente differenti.L'analisi di cumpunenti principali (PCA) è l'analisi discriminante parziale di i minimi quadrati (PLS-DA) sò stati analizati cù u pacchettu di software ropls (v.1.26.4) cù a normalizazione di stack è autoscaling.U mudellu di biomarcatore di metabolite ottimali per a prediczione di a malignità di noduli hè stata generata cù a regressione logistica binaria cù l'operatore di selezzione minimu assolutu (LASSO, R package v.4.1-3).A prestazione di u mudellu discriminante in i setti di deteczione è validazione hè stata carattarizata da l'estimazione di l'AUC basatu annantu à l'analisi ROC secondu u pacchettu pROC (v.1.18.0.).U cutoff di probabilità ottima hè stata ottenuta basatu annantu à l'indici Youden massimu di u mudellu (sensibilità + specificità - 1).Campioni cù valori menu o più grande di u sogliu seranu previsti cum'è noduli benigni è adenocarcinoma pulmonu, rispettivamente.
E cellule A549 (#CCL-185, American Type Culture Collection) sò state cultivate in mediu F-12K chì cuntene 10% FBS.Short hairpin RNA (shRNA) sequences targeting SLC7A5 è un cuntrollu nontargeting (NC) sò stati inseriti in u vector lentiviral pLKO.1-puro.E sequenze antisensu di shSLC7A5 sò i seguenti: Sh1 (5′-GGAGAAACCTGATGAACAGTT-3′), Sh2 (5′-GCCGTGGACTTCGGGAACTAT-3′).L'anticorpi à SLC7A5 (# 5347) è a tubulina (# 2148) sò stati acquistati da Cell Signaling Technology.L'anticorpi à SLC7A5 è a tubulina sò stati utilizati à una diluzione di 1: 1000 per l'analisi Western blot.
U Seahorse XF Glycolytic Stress Test misura i livelli di acidificazione extracellulare (ECAR).In l'assay, glucose, oligomycin A è 2-DG sò stati amministrati in sequenza per pruvà a capacità glicolitica cellulare misurata da ECAR.
E cellule A549 trasfettate cù un cuntrollu non-targeting (NC) è shSLC7A5 (Sh1, Sh2) sò state plated overnight in piatti di 10 cm di diametru.I metaboliti di a cellula sò stati estratti cù 1 ml di metanolu 80% acqua di ghiaccio.E cellule in a suluzione di metanolu sò state scraped off, cullate in un novu tubu, è centrifugate à 15,000 × g per 15 min à 4 ° C.Raccoglie 800 µl di surnatante e asciugate usando un concentratore di vacuum ad alta velocità.I pellets di metaboliti secchi sò stati poi analizati per i livelli di triptofanu utilizendu LC-MS / MS cum'è descrittu sopra.I livelli di NAD(H) cellulari in cellule A549 (NC è shSLC7A5) sò stati misurati cù un kit colorimetricu NAD +/NADH quantitativo (#K337, BioVision) secondu l'istruzzioni di u fabricatore.I livelli di proteini sò stati misurati per ogni mostra per nurmalizà a quantità di metaboliti.
Nisun mètudu statisticu hè statu utilizatu per determinà preliminarmente a dimensione di mostra.Studi di metabolomica precedente destinati à a scuperta di biomarcatori15,18 sò stati cunsiderati cum'è punti di riferimentu per a determinazione di a dimensione, è paragunatu à questi rapporti, a nostra mostra era adatta.Nisuna mostra hè stata esclusa da a cohorte di studiu.I campioni di serum sò stati assignati aleatoriamente à un gruppu di scuperta (casi 306, 74,6%) è un gruppu di validazione internu (casi 104, 25,4%) per studii di metabolomica senza mira.Avemu ancu selezziunatu aleatoriamente 70 casi da ogni gruppu da u set di scuperta per studii metabolomici mirati.L'investigatori sò stati cecati à l'assignazione di u gruppu durante a raccolta di dati è l'analisi LC-MS.L'analisi statistiche di e dati di metabolomica è l'esperimenti di cellula sò descritti in i rùbbriche Risultati, Legends di Figura è Metodi.A quantificazione di triptofanu cellulare, NADT è attività glicolitica hè stata realizata trè volte indipindentamente cù risultati identici.
Per più infurmazione nantu à u disignu di studiu, vede u Natural Portfolio Report Abstract assuciatu à questu articulu.
I dati MS crudi di e caratteristiche estratte è i dati MS nurmalizzati di u siru di riferimentu sò mostrati in Dati Supplementari 1 è Dati Supplementari 2, rispettivamente.L'annotazioni di punta per e funzioni differenziali sò presentati in Dati Supplementari 3. U dataset LUAD TCGA pò esse scaricatu da https://portal.gdc.cancer.gov/.I dati di input per a traccia di u graficu sò furniti in i dati fonte.A fonte di dati hè furnita per questu articulu.
National Lung Screening Study Group, etc. Reducing mortality cancer di pulmone cù tomografia computerizzata di dosi bassu.Inghilterra di u Nordu.J. Med.365, 395–409 (2011).
Kramer, BS, Berg, KD, Aberle, DR è Prophet, PC Screening di u cancer di u pulmone utilizendu una TC hélicoïdale à dosi bassu: risultati da u National Lung Screening Study (NLST).J. Med.Screen 18, 109-111 (2011).
De Koning, HJ, et al.Riduzzione di a mortalità di u cancer di pulmone cù u screening volumetric CT in un prucessu randomizatu.Inghilterra di u Nordu.J. Med.382, 503–513 (2020).
Tempu di post: 18-sep-2023