A diagnosi differenziale di i noduli pulmonari identificati da a tomografia computerizzata (TC) ferma una sfida in a pratica clinica. Quì, caratterizemu u metaboloma globale di 480 campioni di sieru, cumpresi cuntrolli sani, noduli pulmonari benigni è adenocarcinoma pulmonare di stadiu I. L'adenocarcinomi mostranu profili metabolomici unichi, mentre chì i noduli benigni è l'individui sani anu una alta similitudine in i profili metabolomici. In u gruppu di scuperta (n = 306), hè statu identificatu un inseme di 27 metaboliti per differenzià trà noduli benigni è maligni. L'AUC di u mudellu discriminante in i gruppi di validazione interna (n = 104) è di validazione esterna (n = 111) era rispettivamente di 0,915 è 0,945. L'analisi di a via metabolica hà rivelatu un aumentu di metaboliti glicolitici assuciati à una diminuzione di u triptofanu in u sieru di l'adenocarcinoma pulmonare paragunatu à i noduli benigni è i cuntrolli sani, è hà suggeritu chì l'assorbimentu di triptofanu prumove a glicolisi in e cellule di u cancru pulmonare. U nostru studiu mette in risaltu u valore di i biomarcatori di metaboliti sierichi in a valutazione di u risicu di noduli pulmonari rilevati da a TC.
Una diagnosi precoce hè cruciale per migliurà i tassi di sopravvivenza per i pazienti cun cancru. I risultati di u US National Lung Cancer Screening Trial (NLST) è di u studiu europeu NELSON anu dimustratu chì u screening cù a tomografia computerizzata à bassa dosa (LDCT) pò riduce significativamente a mortalità per cancru di u pulmone in i gruppi à altu risicu1,2,3. Dapoi l'usu diffusu di LDCT per u screening di u cancru di u pulmone, l'incidenza di risultati radiografici incidentali di noduli pulmonari asintomatici hà cuntinuatu à aumentà4. I noduli pulmonari sò definiti cum'è opacità focali finu à 3 cm di diametru5. Avemu difficultà à valutà a probabilità di malignità è à trattà u grande numeru di noduli pulmonari rilevati incidentalmente nantu à LDCT. E limitazioni di a CT ponu purtà à esami di seguitu frequenti è risultati falsi pusitivi, chì portanu à interventi inutili è trattamenti eccessivi6. Dunque, ci hè bisognu di sviluppà biomarcatori affidabili è utili per identificà currettamente u cancru di u pulmone in e prime fasi è differenzià a maiò parte di i noduli benigni à a rilevazione iniziale7.
L'analisi moleculare cumpleta di u sangue (serum, plasma, cellule mononucleari di u sangue perifericu), cumprese a genomica, a proteomica o a metilazione di u DNA8,9,10, hà purtatu à un interessu crescente per a scuperta di biomarcatori diagnostichi per u cancru di u pulmone. Intantu, l'approcci metabolomichi misuranu i prudutti finali cellulari chì sò influenzati da azzioni endogene è esogene è sò dunque applicati per predisce l'iniziu è l'esitu di a malatia. A cromatografia liquida-spettrometria di massa tandem (LC-MS) hè un metudu largamente utilizatu per i studii metabolomichi per via di a so alta sensibilità è di a so larga gamma dinamica, chì pò copre metaboliti cù diverse proprietà fisico-chimiche11,12,13. Ancu s'è l'analisi metabolomica glubale di plasma/serum hè stata utilizata per identificà biomarcatori assuciati à a diagnosi di u cancru di u pulmone14,15,16,17 è à l'efficacia di u trattamentu,18 i classificatori di metaboliti sierichi per distingue trà noduli pulmonari benigni è maligni restanu da studià assai. -ricerca massiccia.
L'adenocarcinoma è u carcinoma à cellule squamose sò i dui principali sottotipi di cancru di u pulmone micca à piccule cellule (NSCLC). Diversi testi di screening CT indicanu chì l'adenocarcinoma hè u tipu istologicu più cumunu di cancru di u pulmone1,19,20,21. In questu studiu, avemu utilizatu a cromatografia liquida à ultra-prestazioni-spettrometria di massa à alta risoluzione (UPLC-HRMS) per realizà analisi metabolomica nantu à un totale di 695 campioni di sieru, cumpresi cuntrolli sani, noduli pulmonari benigni è ≤3 cm rilevati da CT. Screening per l'adenocarcinoma pulmonare di stadiu I. Avemu identificatu un pannellu di metaboliti sierichi chì distinguenu l'adenocarcinoma pulmonare da i noduli benigni è i cuntrolli sani. L'analisi di l'arricchimentu di a via hà rivelatu chì u metabolismu anormale di u triptofanu è di u glucosiu sò alterazioni cumuni in l'adenocarcinoma pulmonare paragunatu à i noduli benigni è i cuntrolli sani. Infine, avemu stabilitu è validatu un classificatore metabolicu siericu cù alta specificità è sensibilità per distingue trà i noduli pulmonari maligni è benigni rilevati da LDCT, chì pò aiutà in a diagnosi differenziale precoce è a valutazione di u risicu.
In u studiu attuale, sò stati raccolti retrospettivamente campioni di serum currispondenti per sessu è età da 174 cuntrolli sani, 292 pazienti cun noduli pulmonari benigni è 229 pazienti cun adenocarcinoma pulmonare di stadiu I. E caratteristiche demografiche di i 695 sughjetti sò mostrate in a Tabella Supplementare 1.
Cum'è mostratu in a Figura 1a, un totale di 480 campioni di serum, cumpresi 174 cuntrolli sani (HC), 170 noduli benigni (BN) è 136 campioni di adenocarcinoma pulmonare di stadiu I (LA), sò stati raccolti à u Centru di Cancru di l'Università Sun Yat-sen. Coorte di scuperta per a prufilatura metabolomica senza target utilizendu a cromatografia liquida à ultra-prestazioni-spettrometria di massa à alta risoluzione (UPLC-HRMS). Cum'è mostratu in a Figura Supplementare 1, i metaboliti differenziali trà LA è HC, LA è BN sò stati identificati per stabilisce un mudellu di classificazione è esplorà ulteriormente l'analisi di e vie differenziali. 104 campioni raccolti da u Centru di Cancru di l'Università Sun Yat-sen è 111 campioni raccolti da altri dui ospedali sò stati sottumessi à validazione interna è esterna, rispettivamente.
a Pupulazione di studiu in a coorte di scuperta chì hè stata sottumessa à analisi metabolomica di u sieru glubale utilizendu cromatografia liquida ultra-prestazioni-spettrometria di massa ad alta risoluzione (UPLC-HRMS). b Analisi discriminante di i minimi quadrati parziali (PLS-DA) di u metaboloma tutale di 480 campioni di sieru da a coorte di studiu, cumpresi cuntrolli sani (HC, n = 174), noduli benigni (BN, n = 170) è adenocarcinoma pulmonare di stadiu I (Los Angeles, n = 136). +ESI, modalità di ionizazione elettrospray positiva, -ESI, modalità di ionizazione elettrospray negativa. c-e I metaboliti cù abbundanze significativamente diverse in dui gruppi dati (test di ranghi cù segnu di Wilcoxon à duie code, valore p aghjustatu per a percentuale di scuperta falsa, FDR <0,05) sò mostrati in rossu (cambiamentu di piega > 1,2) è blu (cambiamentu di piega < 0,83). ) mostrati nantu à u graficu di u vulcanu. f Mappa di calore di clustering gerarchicu chì mostra differenze significative in u numeru di metaboliti annotati trà LA è BN. I dati surghjenti sò furniti in forma di fugliali di dati surghjenti.
U metaboloma siericu tutale di 174 HC, 170 BN è 136 LA in u gruppu di scuperta hè statu analizatu cù l'analisi UPLC-HRMS. Prima mostremu chì i campioni di cuntrollu di qualità (QC) si raggruppanu strettamente à u centru di un mudellu di analisi di i cumpunenti principali (PCA) senza supervisione, cunfirmendu a stabilità di e prestazioni di u studiu attuale (Figura Supplementare 2).
Cum'è mostratu in l'analisi discriminante di i minimi quadrati parziali (PLS-DA) in a Figura 1 b, avemu trovu chì ci eranu differenze chjare trà LA è BN, LA è HC in i modi di ionizazione elettrospray pusitiva (+ESI) è negativa (−ESI). isolatu. Tuttavia, ùn sò state trovate differenze significative trà BN è HC in e cundizioni +ESI è -ESI.
Avemu trovu 382 caratteristiche differenziali trà LA è HC, 231 caratteristiche differenziali trà LA è BN, è 95 caratteristiche differenziali trà BN è HC (test di ranghi cù segnu di Wilcoxon, FDR <0,05 è cambiamentu multiplu > 1,2 o <0,83) (Figura .1c-e). . I picchi sò stati ulteriormente annotati (Dati Supplementari 3) contr'à una basa di dati (biblioteca mzCloud/HMDB/Chemspider) per valore m/z, tempu di ritenzione è ricerca di spettru di massa di frammentazione (dettagli descritti in a sezione Metodi) 22. Infine, 33 è 38 metaboliti annotati cù differenze significative in abbundanza sò stati identificati per LA versus BN (Figura 1f è Tabella Supplementare 2) è LA versus HC (Figura Supplementare 3 è Tabella Supplementare 2), rispettivamente. In cuntrastu, solu 3 metaboliti cù differenze significative in abbundanza sò stati identificati in BN è HC (Tabella Supplementare 2), coerente cù a sovrapposizione trà BN è HC in PLS-DA. Questi metaboliti differenziali coprenu una vasta gamma di biochimici (Figura Supplementare 4). Pigliati inseme, questi risultati mostranu cambiamenti significativi in u metaboloma siericu chì riflettenu a trasfurmazione maligna di u cancru di u pulmone in stadiu iniziale paragunatu à i noduli pulmonari benigni o à i sughjetti sani. Intantu, a similitudine di u metaboloma siericu di BN è HC suggerisce chì i noduli pulmonari benigni possinu sparte parechje caratteristiche biologiche cù l'individui sani. Datu chì e mutazioni di u genu di u receptore di u fattore di crescita epidermica (EGFR) sò cumuni in u sottotipu 23 di l'adenocarcinoma pulmonare, avemu cercatu di determinà l'impattu di e mutazioni driver nantu à u metaboloma siericu. Avemu dopu analizatu u prufilu metabolomicu generale di 72 casi cù u statutu EGFR in u gruppu di l'adenocarcinoma pulmonare. Hè interessante nutà chì avemu trovu prufili paragunabili trà i pazienti mutanti EGFR (n = 41) è i pazienti di tipu salvaticu EGFR (n = 31) in l'analisi PCA (Figura Supplementare 5a). Tuttavia, avemu identificatu 7 metaboliti chì a so abbundanza era significativamente alterata in i pazienti cun mutazione EGFR paragunatu à i pazienti cun EGFR di tipu salvaticu (test t, p < 0,05 è cambiamentu di volta > 1,2 o < 0,83) (Figura Supplementare 5b). A maiò parte di sti metaboliti (5 su 7) sò acilcarnitine, chì ghjocanu un rolu impurtante in e vie di l'ossidazione di l'acidi grassi.
Cum'è illustratu in u flussu di travagliu mostratu in a Figura 2a, i biomarcatori per a classificazione di i noduli sò stati ottenuti utilizendu operatori di minima contrazione assoluta è selezzione basata annantu à 33 metaboliti differenziali identificati in LA (n = 136) è BN (n = 170). A megliu cumbinazione di variabili (LASSO) - mudellu di regressione logistica binaria. A validazione incruciata di dece volte hè stata aduprata per testà l'affidabilità di u mudellu. A selezzione di variabili è a regularizazione di i parametri sò aghjustate da una penalità di massimizazione di a probabilità cù u parametru λ24. L'analisi metabolomica globale hè stata ulteriormente realizata indipindentamente in i gruppi di validazione interna (n = 104) è di validazione esterna (n = 111) per testà e prestazioni di classificazione di u mudellu discriminante. Di cunsiguenza, 27 metaboliti in u set di scuperta sò stati identificati cum'è u megliu mudellu discriminante cù u più grande valore mediu di AUC (Fig. 2b), frà i quali 9 avianu una attività aumentata è 18 una attività diminuita in LA paragunatu à BN (Fig. 2c).
Flussu di travagliu per a custruzzione di un classificatore di noduli pulmonari, cumprese a selezzione di u megliu pannellu di metaboliti sierichi in u set di scuperta utilizendu un mudellu di regressione logistica binaria via validazione incruciata à dece volte è a valutazione di e prestazioni predittive in set di validazione interni è esterni. b Statistiche di validazione incruciata di u mudellu di regressione LASSO per a selezzione di biomarcatori metabolichi. I numeri dati sopra rapprisentanu u numeru mediu di biomarcatori selezziunati à un λ datu. A linea punteggiata rossa rapprisenta u valore mediu di l'AUC à a lambda currispondente. E barre d'errore grisge rapprisentanu i valori di l'AUC minimi è massimi. A linea punteggiata indica u megliu mudellu cù i 27 biomarcatori selezziunati. AUC, area sottu à a curva di a caratteristica operativa di u ricevitore (ROC). c Cambiamenti di piega di 27 metaboliti selezziunati in u gruppu LA paragunatu à u gruppu BN in u gruppu di scuperta. Colonna rossa - attivazione. A colonna blu hè un declinu. d-f Curve di a caratteristica operativa di u ricevitore (ROC) chì mostranu a putenza di u mudellu discriminante basatu annantu à 27 cumminazzioni di metaboliti in i set di validazione di scuperta, interni è esterni. I dati di fonte sò furniti in forma di fugliali di dati di fonte.
Un mudellu di predizione hè statu creatu basatu annantu à i cuefficienti di regressione ponderati di sti 27 metaboliti (Tabella Supplementare 3). L'analisi ROC basata annantu à sti 27 metaboliti hà datu un valore di area sottu à a curva (AUC) di 0,933, a sensibilità di u gruppu di scuperta era 0,868, è a specificità era 0,859 (Fig. 2d). Intantu, trà i 38 metaboliti differenziali annotati trà LA è HC, un inseme di 16 metaboliti hà ottenutu un AUC di 0,902 cù una sensibilità di 0,801 è una specificità di 0,856 in a discriminazione di LA da HC (Figura Supplementare 6a-c). I valori AUC basati annantu à diverse soglie di cambiamentu di piega per i metaboliti differenziali sò stati ancu paragunati. Avemu trovu chì u mudellu di classificazione hà datu u megliu risultatu in a discriminazione trà LA è BN (HC) quandu u livellu di cambiamentu di piega era impostu à 1,2 versus 1,5 o 2,0 (Figura Supplementare 7a,b). U mudellu di classificazione, basatu annantu à 27 gruppi di metaboliti, hè statu ulteriormente validatu in coorti interne è esterne. L'AUC era 0,915 (sensibilità 0,867, specificità 0,811) per a validazione interna è 0,945 (sensibilità 0,810, specificità 0,979) per a validazione esterna (Fig. 2e, f). Per valutà l'efficienza interlaboratoria, 40 campioni di a coorte esterna sò stati analizati in un laburatoriu esternu cum'è descrittu in a sezione Metodi. A precisione di classificazione hà ottenutu un'AUC di 0,925 (Figura Supplementare 8). Siccome u carcinoma à cellule squamose pulmonari (LUSC) hè u secondu sottotipu più cumunu di cancru pulmonare non à cellule chjuche (NSCLC) dopu l'adenocarcinoma pulmonare (LUAD), avemu ancu testatu l'utilità potenziale validata di i profili metabolichi. BN è 16 casi di LUSC. L'AUC di discriminazione trà LUSC è BN era 0,776 (Figura Supplementare 9), chì indica una capacità più scarsa paragunata à a discriminazione trà LUAD è BN.
Studi anu dimustratu chì a dimensione di i noduli nantu à l'imaghjini CT hè pusitivamente correlata cù a probabilità di malignità è ferma un determinante maiò di u trattamentu di i noduli25,26,27. L'analisi di i dati di a grande coorte di u studiu di screening NELSON hà dimustratu chì u risicu di malignità in i sughjetti cù noduli <5 mm era ancu simile à quellu in i sughjetti senza noduli 28. Dunque, a dimensione minima chì richiede un monitoraghju CT regulare hè 5 mm, cum'è raccomandatu da a British Thoracic Society (BTS), è 6 mm, cum'è raccomandatu da a Fleischner Society 29. Tuttavia, i noduli più grandi di 6 mm è senza caratteristiche benigne evidenti, chjamati noduli pulmonari indeterminati (IPN), restanu una sfida maiò in a valutazione è a gestione in a pratica clinica30,31. Dopu avemu esaminatu se a dimensione di i noduli hà influenzatu e firme metabolomiche utilizendu campioni raggruppati da e coorti di scuperta è di validazione interna. Cuncentrandosi nantu à 27 biomarcatori validati, avemu prima paragunatu i profili PCA di i metabolomi HC è BN sub-6 mm. Avemu trovu chì a maiò parte di i punti di dati per HC è BN si sovrapponenu, dimustrendu chì i livelli di metaboliti sierichi eranu simili in i dui gruppi (Fig. 3a). E carte di caratteristiche in diverse gamme di dimensioni sò rimaste cunservate in BN è LA (Fig. 3b, c), mentre chì una separazione hè stata osservata trà i noduli maligni è benigni in a gamma 6-20 mm (Fig. 3d). Questa coorte avia una AUC di 0,927, una specificità di 0,868 è una sensibilità di 0,820 per predisce a malignità di i noduli chì misuranu da 6 à 20 mm (Fig. 3e, f). I nostri risultati mostranu chì u classificatore pò catturà i cambiamenti metabolichi causati da a trasfurmazione maligna precoce, indipendentemente da a dimensione di i noduli.
ad Cunfrontu di i profili PCA trà gruppi specificati basatu annantu à un classificatore metabolicu di 27 metaboliti. CC è BN < 6 mm. b BN < 6 mm vs BN 6-20 mm. in LA 6-20 mm versus LA 20-30 mm. g BN 6-20 mm è LA 6-20 mm. GC, n = 174; BN < 6 mm, n = 153; BN 6-20 mm, n = 91; LA 6-20 mm, n = 89; LA 20-30 mm, n = 77. e Curva di a caratteristica operativa di u ricevitore (ROC) chì mostra e prestazioni di u mudellu discriminante per i noduli 6-20 mm. f I valori di probabilità sò stati calculati basatu annantu à u mudellu di regressione logistica per i noduli chì misuranu 6-20 mm. A linea punteggiata grisgia rapprisenta u valore di cutoff ottimale (0,455). I numeri sopra rapprisentanu a percentuale di casi previsti per Los Angeles. Aduprate un test t di Student à duie code. PCA, analisi di i cumpunenti principali. Area AUC sottu à a curva. I dati surghjenti sò furniti in forma di fugliali di dati surghjenti.
Quattru campioni (di età trà 44 è 61 anni) cù dimensioni simili di noduli pulmonari (7-9 mm) sò stati ulteriormente selezziunati per illustrà a prestazione di u mudellu di predizione di malignità prupostu (Fig. 4a, b). À u screening iniziale, u Casu 1 si prisentava cum'è un nodulu solidu cù calcificazione, una caratteristica assuciata à a benignità, mentre chì u Casu 2 si prisentava cum'è un nodulu parzialmente solidu indeterminatu senza caratteristiche benigne evidenti. Trè cicli di scansioni TC di seguitu anu dimustratu chì questi casi sò rimasti stabili per un periodu di 4 anni è sò stati dunque cunsiderati noduli benigni (Fig. 4a). In paragone cù a valutazione clinica di scansioni TC seriali, l'analisi di metaboliti sierichi à dose unica cù l'attuale mudellu di classificazione hà identificatu rapidamente è currettamente questi noduli benigni basati nantu à vincoli probabilistici (Tabella 1). A Figura 4b in u casu 3 mostra un nodulu cù segni di retrazione pleurica, chì hè più spessu assuciata à a malignità32. U Casu 4 si prisentava cum'è un nodulu parzialmente solidu indeterminatu senza evidenza di una causa benigna. Tutti questi casi sò stati previsti cum'è maligni secondu u mudellu di classificazione (Tavula 1). A valutazione di l'adenocarcinoma pulmonariu hè stata dimustrata da esame istopatologicu dopu a chirurgia di resezione pulmonare (Fig. 4b). Per u set di validazione esterna, u classificatore metabolicu hà previstu accuratamente dui casi di noduli pulmonari indeterminati più grandi di 6 mm (Figura Supplementare 10).
Imagine TC di a finestra assiale di i pulmoni di dui casi di noduli benigni. In u casu 1, a scansione TC dopu à 4 anni hà mostratu un nodulu solidu stabile chì misura 7 mm cù calcificazione in u lobu inferiore drittu. In u casu 2, a scansione TC dopu à 5 anni hà rivelatu un nodulu stabile, parzialmente solidu cù un diametru di 7 mm in u lobu superiore drittu. b Imagine TC di a finestra assiale di i pulmoni è studii patologichi currispondenti di dui casi di adenocarcinoma di stadiu I prima di a resezione pulmonare. U casu 3 hà rivelatu un nodulu cù un diametru di 8 mm in u lobu superiore drittu cù retrazione pleurica. U casu 4 hà rivelatu un nodulu parzialmente solidu in vetru smerigliatu chì misura 9 mm in u lobu superiore sinistro. Colorazione cù ematossilina è eosina (H&E) di u tissutu pulmonare resecatu (barra di scala = 50 μm) chì dimostra u mudellu di crescita acinare di l'adenocarcinoma pulmonare. E frecce indicanu i noduli rilevati nantu à l'imagine TC. L'imagine H&E sò imagine rappresentative di multipli (> 3) campi microscopici esaminati da u patologu.
Pigliati inseme, i nostri risultati dimustranu u valore putenziale di i biomarcatori di metaboliti sierichi in a diagnosi differenziale di i noduli pulmonari, chì pò presentà sfide quandu si valuta u screening CT.
Basatu annantu à un pannellu di metaboliti differenziali validatu, avemu cercatu d'identificà i correlati biologichi di i principali cambiamenti metabolichi. L'analisi d'arricchimentu di a via KEGG da MetaboAnalyst hà identificatu 6 vie cumuni significativamente alterate trà i dui gruppi dati (LA vs. HC è LA vs. BN, p ≤ 0,001 aghjustatu, effettu > 0,01). Quessi cambiamenti eranu carattarizati da disturbi in u metabolismu di u piruvatu, u metabolismu di u triptofanu, u metabolismu di a niacina è di a nicotinamide, a glicolisi, u ciclu TCA è u metabolismu di e purine (Fig. 5a). Avemu dopu realizatu metabolomichi mirati per verificà i cambiamenti maiò utilizendu a quantificazione assoluta. Determinazione di metaboliti cumuni in vie cumunemente alterate per spettrometria di massa à triplu quadrupolo (QQQ) utilizendu standard di metaboliti autentichi. E caratteristiche demografiche di u campione di destinazione di u studiu metabolomicu sò incluse in a Tavula Supplementare 4. In cunfurmità cù i nostri risultati metabolomichi glubali, l'analisi quantitativa hà cunfirmatu chì l'ipoxantina è a xantina, u piruvatu è u lattatu eranu aumentati in LA paragunatu à BN è HC (Fig. 5b, c, p <0,05). Tuttavia, ùn sò state trovate differenze significative in questi metaboliti trà BN è HC.
Analisi di l'arricchimentu di a via KEGG di metaboliti significativamente diversi in u gruppu LA paragunatu à i gruppi BN è HC. Hè statu utilizatu un Globaltest à duie code, è i valori p sò stati aghjustati cù u metudu Holm-Bonferroni (p aghjustatu ≤ 0,001 è dimensione di l'effettu > 0,01). b-d Grafici di viulinu chì mostranu i livelli di ipoxantina, xantina, lattatu, piruvatu è triptofanu in u sieru HC, BN è LA determinati da LC-MS/MS (n = 70 per gruppu). E linee punteggiate bianche è nere indicanu rispettivamente a mediana è u quartile. e Graficu di viulinu chì mostra l'espressione di mRNA Log2TPM (trascritti per milione) nurmalizzata di SLC7A5 è QPRT in l'adenocarcinoma pulmonare (n = 513) paragunatu à u tissutu pulmonare nurmale (n = 59) in u dataset LUAD-TCGA. A scatula bianca rapprisenta a gamma interquartile, a linea nera orizzontale in u centru rapprisenta a mediana, è a linea nera verticale chì si estende da a scatula rapprisenta l'intervallu di cunfidenza di 95% (CI). f Graficu di currelazione di Pearson di l'espressione di SLC7A5 è GAPDH in l'adenocarcinoma pulmonariu (n = 513) è u tissutu pulmonariu nurmale (n = 59) in u dataset TCGA. L'area grisgia rapprisenta u 95% CI. r, coefficientu di currelazione di Pearson. g Livelli cellulari di triptofanu nurmalizati in e cellule A549 trasfettate cù cuntrollu shRNA non specificu (NC) è shSLC7A5 (Sh1, Sh2) determinati da LC-MS/MS. Hè presentata l'analisi statistica di cinque campioni biologicamente indipendenti in ogni gruppu. h Livelli cellulari di NADt (NAD tutale, cumpresi NAD+ è NADH) in e cellule A549 (NC) è e cellule A549 SLC7A5 knockdown (Sh1, Sh2). Hè presentata l'analisi statistica di trè campioni biologicamente indipendenti in ogni gruppu. L'attività glicolitica di e cellule A549 prima è dopu a soppressione di SLC7A5 hè stata misurata da u tassu di acidificazione extracellulare (ECAR) (n = 4 campioni biologicamente indipendenti per gruppu). 2-DG,2-deossi-D-glucosio. U test t di Student à duie code hè statu utilizatu in (b-h). In (g-i), e barre d'errore rapprisentanu a media ± SD, ogni esperimentu hè statu realizatu trè volte indipindentamente è i risultati eranu simili. I dati surghjenti sò furniti in forma di fugliali di dati surghjenti.
Cunsiderendu l'impattu significativu di u metabolismu alteratu di u triptofanu in u gruppu LA, avemu ancu valutatu i livelli sierichi di triptofanu in i gruppi HC, BN è LA aduprendu QQQ. Avemu trovu chì u triptofanu sierico era riduttu in LA paragunatu à HC o BN (p < 0,001, Figura 5d), ciò chì hè coerente cù i risultati precedenti chì i livelli circulanti di triptofanu sò più bassi in i pazienti cun cancru di u pulmone chè in i cuntrolli sani di u gruppu di cuntrollu33,34,35. Un altru studiu chì utilizava u tracciante PET/CT 11C-metil-L-triptofanu hà trovu chì u tempu di ritenzione di u signale di triptofanu in u tissutu di u cancru di u pulmone era significativamente aumentatu paragunatu à e lesioni benigne o à u tissutu nurmale36. Ipotizzemu chì a diminuzione di u triptofanu in u sieru LA pò riflette l'assorbimentu attivu di triptofanu da e cellule di u cancru di u pulmone.
Hè ancu cunnisciutu chì u pruduttu finale di a via di a kynurenina di u catabolismu di u triptofanu hè NAD+37,38, chì hè un substratu impurtante per a reazione di a gliceraldeide-3-fosfatu cù l'1,3-bisfosfogliceratu in a glicolisi39. Mentre chì i studii precedenti si sò cuncentrati nantu à u rolu di u catabolismu di u triptofanu in a regulazione immune, avemu cercatu di elucidà l'interazione trà a disregulazione di u triptofanu è e vie glicolitiche osservate in u studiu attuale. U membru 5 di a famiglia di trasportatori di soluti 7 (SLC7A5) hè cunnisciutu per esse un trasportatore di triptofanu43,44,45. A fosforibosiltransferasi di l'acidu chinolinicu (QPRT) hè un enzima situatu à valle di a via di a kynurenina chì cunverte l'acidu chinolinicu in NAMN46. L'ispezione di u dataset LUAD TCGA hà rivelatu chì sia SLC7A5 sia QPRT eranu significativamente sovraregulati in u tissutu tumorale paragunatu à u tissutu nurmale (Fig. 5e). Questu aumentu hè statu osservatu in i stadii I è II è ancu in i stadii III è IV di l'adenocarcinoma pulmonariu (Figura Supplementare 11), chì indica disturbi precoci in u metabolismu di u triptofanu assuciati à a tumorigenesi.
Inoltre, u dataset LUAD-TCGA hà mostratu una currelazione pusitiva trà l'espressione di l'mRNA di SLC7A5 è GAPDH in campioni di pazienti cun cancru (r = 0,45, p = 1,55E-26, Figura 5f). In cuntrastu, ùn hè stata trovata alcuna currelazione significativa trà tali firme geniche in u tissutu pulmonariu nurmale (r = 0,25, p = 0,06, Figura 5f). A riduzione di SLC7A5 (Figura Supplementare 12) in e cellule A549 hà riduttu significativamente i livelli cellulari di triptofanu è NAD(H) (Figura 5g,h), risultendu in una attività glicolitica attenuata cum'è misurata da u tassu di acidificazione extracellulare (ECAR) (Figura 1). 5i). Cusì, basatu annantu à i cambiamenti metabolichi in u serumu è a rilevazione in vitro, ipotizzemu chì u metabolismu di u triptofanu pò pruduce NAD+ attraversu a via di a chinurenina è ghjucà un rolu impurtante in a prumuzione di a glicolisi in u cancru di u pulmone.
Studi anu dimustratu chì un gran numeru di noduli pulmonari indeterminati rilevati da LDCT pò purtà à a necessità di testi supplementari cum'è PET-CT, biopsia pulmonare è trattamentu eccessivu per via di una diagnosi falsa positiva di malignità.31 Cum'è mostratu in a Figura 6, u nostru studiu hà identificatu un pannellu di metaboliti sierichi cù un valore diagnosticu potenziale chì pò migliurà a stratificazione di u risicu è a gestione successiva di i noduli pulmonari rilevati da CT.
I noduli pulmonari sò valutati cù a tomografia computerizzata à bassa dosa (LDCT) cù caratteristiche d'imaghjini chì suggerenu cause benigne o maligne. L'esitu incertu di i noduli pò purtà à visite di seguitu frequenti, interventi inutili è trattamenti eccessivi. L'inclusione di classificatori metabolichi sierichi cù valore diagnosticu pò migliurà a valutazione di u risicu è a gestione successiva di i noduli pulmonari. Tomografia à emissione di positroni PET.
I dati di u studiu NLST americanu è di u studiu europeu NELSON suggerenu chì u screening di i gruppi à altu risicu cù a tomografia computerizzata à bassa dosa (LDCT) pò riduce a mortalità per cancru di u pulmone1,3. Tuttavia, a valutazione di u risicu è a successiva gestione clinica di un gran numeru di noduli pulmonari incidentali rilevati da LDCT restanu i più difficili. L'obiettivu principale hè di ottimizà a classificazione curretta di i protokolli esistenti basati nantu à LDCT incorporendu biomarcatori affidabili.
Certi biomarcatori moleculari, cum'è i metaboliti di u sangue, sò stati identificati paragunendu u cancru di u pulmone cù cuntrolli sani15,17. In u studiu attuale, ci simu cuncentrati nantu à l'applicazione di l'analisi metabolomica sierica per distingue trà i noduli pulmonari benigni è maligni rilevati incidentalmente da LDCT. Avemu paragunatu u metaboloma sierico globale di campioni di cuntrollu sanu (HC), noduli pulmonari benigni (BN) è adenocarcinoma pulmonare di stadiu I (LA) utilizendu l'analisi UPLC-HRMS. Avemu trovu chì HC è BN avianu profili metabolichi simili, mentre chì LA hà mostratu cambiamenti significativi paragunatu à HC è BN. Avemu identificatu dui insemi di metaboliti sierici chì differenzianu LA da HC è BN.
L'attuale schema d'identificazione basatu annantu à LDCT per i noduli benigni è maligni hè principalmente basatu annantu à a dimensione, a densità, a morfologia è u ritmu di crescita di i noduli in u tempu30. Studi precedenti anu dimustratu chì a dimensione di i noduli hè strettamente ligata à a probabilità di cancru di u pulmone. Ancu in i pazienti à altu risicu, u risicu di malignità in i noduli <6 mm hè <1%. U risicu di malignità per i noduli chì misuranu da 6 à 20 mm varia da 8% à 64%30. Dunque, a Società Fleischner raccomanda un diametru di cutoff di 6 mm per u seguitu TC di rutina. 29 Tuttavia, a valutazione di u risicu è a gestione di i noduli pulmonari indeterminati (IPN) più grandi di 6 mm ùn sò state realizate adeguatamente 31. A gestione attuale di e cardiopatie congenite hè generalmente basata annantu à l'attesa vigile cù un monitoraghju TC frequente.
Basatu annantu à u metaboloma validatu, avemu dimustratu per a prima volta a sovrapposizione di e firme metabolomiche trà individui sani è noduli benigni <6 mm. A similitudine biologica hè coerente cù i risultati precedenti di a TC chì u risicu di malignità per i noduli <6 mm hè bassu cum'è per i sughjetti senza noduli.30 Ci vole à nutà chì i nostri risultati dimustranu ancu chì i noduli benigni <6 mm è ≥6 mm anu una alta similitudine in i profili metabolomichi, ciò chì suggerisce chì a definizione funzionale di l'etiologia benigna hè coerente indipendentemente da a dimensione di i noduli. Cusì, i pannelli muderni di metaboliti sierichi diagnostichi ponu furnisce un unicu test cum'è test di esclusione quandu i noduli sò inizialmente rilevati nantu à a TC è potenzialmente riduce u monitoraghju seriale. À u listessu tempu, u listessu pannellu di biomarcatori metabolichi hà distintu i noduli maligni di dimensione ≥6 mm da i noduli benigni è hà furnitu previsioni accurate per IPN di dimensioni simili è caratteristiche morfologiche ambigue nantu à l'imaghjini TC. Stu classificatore di u metabolismu sierico hà avutu boni risultati in a previsione di a malignità di i noduli ≥6 mm cù una AUC di 0,927. Pigliati inseme, i nostri risultati indicanu chì e firme metabolomiche sieriche uniche ponu riflettà specificamente i cambiamenti metabolichi indotti da u tumore precoce è anu un valore potenziale cum'è predittori di risicu, indipendentemente da a dimensione di i noduli.
In particulare, l'adenocarcinoma pulmonariu (LUAD) è u carcinoma à cellule squamose (LUSC) sò i principali tipi di cancru pulmonariu micca à piccule cellule (NSCLC). Datu chì LUSC hè fortemente assuciatu à l'usu di tabaccu47 è LUAD hè l'istologia più cumuna di noduli pulmonari incidentali rilevati nantu à u screening CT48, u nostru mudellu di classificazione hè statu specificamente custruitu per i campioni di adenocarcinoma di stadiu I. Wang è i so culleghi si sò ancu cuncentrati nantu à LUAD è anu identificatu nove firme lipidiche utilizendu a lipidomica per distingue u cancru pulmonariu in stadiu iniziale da individui sani17. Avemu testatu l'attuale mudellu di classificazione nantu à 16 casi di LUSC di stadiu I è 74 noduli benigni è avemu osservatu una bassa precisione di previsione LUSC (AUC 0,776), chì suggerisce chì LUAD è LUSC possinu avè e so proprie firme metabolomiche. In effetti, hè statu dimustratu chì LUAD è LUSC differiscenu in etiologia, origine biologica è aberrazioni genetiche49. Dunque, altri tipi d'istologia devenu esse inclusi in i mudelli di furmazione per a rilevazione di u cancru di u pulmone basata nantu à a pupulazione in i prugrammi di screening.
Quì, avemu identificatu e sei vie più frequentemente alterate in l'adenocarcinoma pulmonariu paragunatu à i cuntrolli sani è i noduli benigni. A xantina è l'ipoxantina sò metaboliti cumuni di a via metabolica di e purine. In cunfurmità cù i nostri risultati, l'intermedi assuciati à u metabolismu di e purine eranu significativamente aumentati in u serum o in i tessuti di i pazienti cun adenocarcinoma pulmonariu paragunatu à i cuntrolli sani o à i pazienti in u stadiu preinvasivu15,50. I livelli elevati di xantina è ipoxantina sierica ponu riflettà l'anabolismu necessariu da e cellule cancerose chì proliferanu rapidamente. A disregulazione di u metabolismu di u glucosiu hè una caratteristica ben cunnisciuta di u metabolismu di u cancru51. Quì, avemu osservatu un aumentu significativu di piruvatu è lattatu in u gruppu LA paragunatu à u gruppu HC è BN, chì hè coerente cù i rapporti precedenti di anomalie di a via glicolitica in i profili di u metaboloma siericu di i pazienti cun cancru pulmonariu micca à piccule cellule (NSCLC) è di i cuntrolli sani. I risultati sò coerenti52,53.
Impurtantemente, avemu osservatu una currelazione inversa trà u metabolismu di u piruvatu è di u triptofanu in u serum di l'adenocarcinomi pulmonari. I livelli sierichi di triptofanu eranu ridutti in u gruppu LA paragunatu à u gruppu HC o BN. Hè interessante nutà chì un studiu precedente à grande scala utilizendu una coorte prospettica hà trovu chì bassi livelli di triptofanu circulante eranu assuciati à un risicu aumentatu di cancru di u pulmone 54. U triptofanu hè un aminoacidu essenziale chì ottenemu interamente da l'alimentu. Cuncludemu chì a deplezione di triptofanu siericu in l'adenocarcinoma pulmonare pò riflette una rapida deplezione di stu metabolitu. Hè ben cunnisciutu chì u pruduttu finale di u catabolismu di u triptofanu via a via di a chinurenina hè a fonte di a sintesi de novo di NAD+. Siccomu NAD+ hè pruduttu principalmente per via di a via di salvataggio, l'impurtanza di NAD+ in u metabolismu di u triptofanu in a salute è in a malatia ferma da determinà46. A nostra analisi di a basa di dati TCGA hà dimustratu chì l'espressione di u trasportatore di soluti di u trasportatore di triptofanu 7A5 (SLC7A5) era significativamente aumentata in l'adenocarcinoma pulmonariu paragunatu à i cuntrolli nurmali è era pusitivamente correlata cù l'espressione di l'enzima glicoliticu GAPDH. Studi precedenti si sò cuncentrati principalmente nantu à u rolu di u catabolismu di u triptofanu in a soppressione di a risposta immune antitumorale40,41,42. Quì dimustremu chì l'inibizione di l'assorbimentu di triptofanu per via di a riduzione di SLC7A5 in e cellule di u cancru pulmonariu si traduce in una successiva diminuzione di i livelli cellulari di NAD è una attenuazione concomitante di l'attività glicolitica. In riassuntu, u nostru studiu furnisce una basa biologica per i cambiamenti in u metabolismu siericu assuciati à a trasfurmazione maligna di l'adenocarcinoma pulmonariu.
E mutazioni di l'EGFR sò e mutazioni driver più cumuni in i pazienti cun NSCLC. In u nostru studiu, avemu trovu chì i pazienti cun mutazione di l'EGFR (n = 41) avianu profili metabolomichi generali simili à i pazienti cun EGFR di tipu salvaticu (n = 31), ancu s'è avemu trovu livelli sierichi diminuiti di certi pazienti mutanti di l'EGFR in i pazienti cun acilcarnitina. A funzione stabilita di l'acilcarnitine hè di trasportà i gruppi acilici da u citoplasma in a matrice mitocondriale, purtendu à l'ossidazione di l'acidi grassi per pruduce energia 55. In cunfurmità cù i nostri risultati, un studiu recente hà ancu identificatu profili metabolomichi simili trà i tumori mutanti di l'EGFR è di tipu salvaticu di l'EGFR analizendu u metabolomicu globale di 102 campioni di tissutu di adenocarcinoma pulmonare 50. Hè interessante nutà chì u cuntenutu di acilcarnitina hè statu ancu trovu in u gruppu mutante di l'EGFR. Dunque, se i cambiamenti in i livelli di acilcarnitina riflettenu i cambiamenti metabolichi indotti da l'EGFR è e vie moleculari sottostanti pò merità ulteriori studii.
In cunclusione, u nostru studiu stabilisce un classificatore metabolicu siericu per a diagnosi differenziale di i noduli pulmonari è propone un flussu di travagliu chì pò ottimizà a valutazione di u risicu è facilità a gestione clinica basata annantu à u screening di a scansione TC.
Stu studiu hè statu appruvatu da u Cumitatu Eticu di l'Ospedale di u Cancru di l'Università Sun Yat-sen, u Primu Ospedale Affiliatu di l'Università Sun Yat-sen, è u Cumitatu Eticu di l'Ospedale di u Cancru di l'Università Zhengzhou. In i gruppi di scuperta è di validazione interna, 174 sieri da individui sani è 244 sieri da noduli benigni sò stati raccolti da individui sottumessi à esami medichi annuali à u Dipartimentu di Cuntrollu è Prevenzione di u Cancru, Centru di u Cancru di l'Università Sun Yat-sen, è 166 noduli benigni. sieru. L'adenocarcinomi pulmonari di stadiu I sò stati raccolti da u Centru di u Cancru di l'Università Sun Yat-sen. In a coorte di validazione esterna, ci eranu 48 casi di noduli benigni, 39 casi di adenocarcinoma pulmonare di stadiu I da u Primu Ospedale Affiliatu di l'Università Sun Yat-sen, è 24 casi di adenocarcinoma pulmonare di stadiu I da l'Ospedale di u Cancru di Zhengzhou. U Centru di Cancru di l'Università Sun Yat-sen hà ancu raccoltu 16 casi di cancru di u pulmone à cellule squamose di stadiu I per testà a capacità diagnostica di u classificatore metabolicu stabilitu (e caratteristiche di i pazienti sò mostrate in a Tabella Supplementare 5). Campioni da a coorte di scuperta è da a coorte di validazione interna sò stati raccolti trà ghjennaghju 2018 è maghju 2020. Campioni per a coorte di validazione esterna sò stati raccolti trà aostu 2021 è uttrovi 2022. Per minimizà u pregiudiziu di genere, un numeru apprussimativamente uguale di casi maschili è femine hè statu assignatu à ogni coorte. Squadra di Scuperta è Squadra di Revisione Interna. U sessu di i participanti hè statu determinatu in basa à l'autovalutazione. U cunsensu infurmatu hè statu ottenutu da tutti i participanti è ùn hè stata furnita alcuna compensazione. I sughjetti cù noduli benigni eranu quelli cù un puntuatu di scansione TC stabile da 2 à 5 anni à u mumentu di l'analisi, eccettu per 1 casu da u campione di validazione esterna, chì hè statu raccoltu prima di l'operazione è diagnosticatu da istopatologia. Cù l'eccezzione di a bronchite cronica. I casi di adenocarcinoma pulmonare sò stati raccolti prima di a resezione pulmonare è cunfirmati da diagnosi patologica. Campioni di sangue à digiunu sò stati raccolti in tubi di separazione di serum senza anticoagulanti. I campioni di sangue sò stati coagulati per 1 ora à temperatura ambiente è dopu centrifugati à 2851 × g per 10 minuti à 4°C per raccoglie u surnatante di u serum. L'aliquote di serum sò state congelate à -80°C finu à l'estrazione di i metaboliti. U Dipartimentu di Prevenzione di u Cancru è Esame Medicu di u Centru di u Cancru di l'Università Sun Yat-sen hà raccoltu un pool di serum da 100 donatori sani, cumpresi un numeru uguale di omi è donne di età trà 40 è 55 anni. Volumi uguali di ogni campione di donatore sò stati mischiati, u pool risultante hè statu aliquotatu è cunservatu à -80°C. A mistura di serum hè stata aduprata cum'è materiale di riferimentu per u cuntrollu di qualità è a standardizazione di i dati.
U serum di riferimentu è i campioni di prova sò stati scongelati è i metaboliti sò stati estratti cù un metudu d'estrazione cumminatu (MTBE/metanol/acqua) 56. In breve, 50 μl di serum sò stati mischiati cù 225 μl di metanol ghiacciatu è 750 μl di metil tert-butile etere (MTBE) ghiacciatu. Mescolate a mistura è incubate nantu à u ghjacciu per 1 ora. I campioni sò stati poi mischiati è vortexati cù 188 μl d'acqua di qualità MS chì cuntene standard interni (13C-lattatu, 13C3-piruvatu, 13C-metionina è 13C6-isoleucina, acquistati da Cambridge Isotope Laboratories). A mistura hè stata poi centrifugata à 15.000 × g per 10 minuti à 4 °C, è a fase inferiore hè stata trasferita in dui tubi (125 μL ognunu) per l'analisi LC-MS in modalità positiva è negativa. Infine, u campione hè statu evaporatu à seccu in un concentratore à vuoto à alta velocità.
I metaboliti secchi sò stati ricostituiti in 120 μl di 80% acetonitrile, vortexati per 5 minuti è centrifugati à 15.000 × g per 10 minuti à 4°C. I supernatanti sò stati trasferiti in fiale di vetru ambratu cù microinserti per studii metabolomichi. Analisi metabolomica senza target nantu à una piattaforma di cromatografia liquida ultra-prestazioni-spettrometria di massa ad alta risoluzione (UPLC-HRMS). I metaboliti sò stati separati utilizendu un sistema Dionex Ultimate 3000 UPLC è una colonna ACQUITY BEH Amide (2,1 × 100 mm, 1,7 μm, Waters). In modalità ionica pusitiva, e fasi mobili eranu 95% (A) è 50% acetonitrile (B), ognuna cuntenendu 10 mmol/L di acetatu d'ammoniu è 0,1% d'acidu formicu. In modu negativu, e fasi mobili A è B cuntenenu 95% è 50% d'acetonitrile, rispettivamente, e duie fasi cuntenenu 10 mmol/L d'acetatu d'ammoniu, pH = 9. U prugramma di gradiente era u seguente: 0–0,5 min, 2% B; 0,5–12 min, 2–50% B; 12–14 min, 50–98% B; 14–16 min, 98% B; 16–16,1 min, 98–2% B; 16,1–20 min, 2% B. A colonna hè stata mantenuta à 40°C è u campione à 10°C in l'autocampionatore. A velocità di flussu era di 0,3 ml/min, u vulume d'iniezione era di 3 μl. Un spettrometru di massa Q-Exactive Orbitrap (Thermo Fisher Scientific) cù una fonte di ionizazione elettrospray (ESI) hè statu utilizatu in modu di scansione cumpleta è accoppiatu cù u modu di monitoraghju ddMS2 per raccoglie grandi volumi di dati. I parametri MS sò stati stabiliti cusì: tensione di spruzzatura +3,8 kV/- 3,2 kV, temperatura capillare 320 °C, gas di prutezzione 40 arb, gas ausiliariu 10 arb, temperatura di u riscaldatore di a sonda 350 °C, intervallu di scansione 70-1050 m/h, risoluzione . 70 000. I dati sò stati acquistati cù Xcalibur 4.1 (Thermo Fisher Scientific).
Per valutà a qualità di i dati, sò stati generati campioni di cuntrollu di qualità (QC) raggruppati rimuovendu aliquote di 10 μL di surnatante da ogni campione. Sei iniezioni di campioni di cuntrollu di qualità sò state analizzate à l'iniziu di a sequenza analitica per valutà a stabilità di u sistema UPLC-MS. I campioni di cuntrollu di qualità sò poi introdutti periodicamente in u batch. Tutti l'11 batch di campioni di serum in questu studiu sò stati analizzati da LC-MS. Aliquote di una mistura di pool di serum da 100 donatori sani sò state aduprate cum'è materiale di riferimentu in i rispettivi batch per monitorà u prucessu di estrazione è aghjustà l'effetti batch-to-batch. L'analisi metabolomica non mirata di a coorte di scuperta, a coorte di validazione interna è a coorte di validazione esterna hè stata realizata à u Centru Metabolomica di l'Università Sun Yat-sen. U laburatoriu esternu di u Centru di Analisi è Test di l'Università di Tecnulugia di Guangdong hà ancu analizatu 40 campioni da a coorte esterna per testà e prestazioni di u mudellu di classificazione.
Dopu l'estrazione è a ricostituzione, a quantificazione assoluta di i metaboliti sierichi hè stata misurata utilizendu a cromatografia liquida à prestazioni ultra elevate-spettrometria di massa tandem (Agilent 6495 triplu quadrupolo) cù una fonte di ionizazione elettrospray (ESI) in modalità di monitoraghju di reazioni multiple (MRM). Una colonna ACQUITY BEH Amide (2,1 × 100 mm, 1,7 μm, Waters) hè stata aduprata per separà i metaboliti. A fase mobile era custituita da 90% (A) è 5% acetonitrile (B) cù 10 mmol/L acetatu d'ammoniu è una soluzione di ammoniaca à 0,1%. U prugramma di gradiente era u seguente: 0–1,5 min, 0% B; 1,5–6,5 min, 0–15% B; 6,5–8 min, 15% B; 8–8,5 min, 15%–0% B; 8,5–11,5 min, 0%B. A colonna hè stata mantenuta à 40 °C è u campione à 10 °C in l'autocampionatore. A velocità di flussu era di 0,3 mL/min è u vulume di iniezione era di 1 μL. I parametri MS sò stati stabiliti cusì: tensione capillare ±3,5 kV, pressione di u nebulizzatore 35 psi, flussu di gas di guaina 12 L/min, temperatura di u gas di guaina 350 °C, temperatura di u gas di essiccazione 250 °C è flussu di gas di essiccazione 14 l/min. E cunversioni MRM di triptofanu, piruvatu, lattatu, ipoxantina è xantina eranu rispettivamente 205,0–187,9, 87,0–43,4, 89,0–43,3, 135,0–92,3 è 151,0–107,9. I dati sò stati raccolti cù Mass Hunter B.07.00 (Agilent Technologies). Per i campioni di serumu, u triptofanu, u piruvatu, u lattatu, l'ipoxantina è a xantina sò stati quantificati aduprendu curve di calibrazione di suluzioni di mistura standard. Per i campioni cellulari, u cuntenutu di triptofanu hè statu nurmalizatu à u standard internu è à a massa proteica cellulare.
L'estrazione di picchi (m/z è tempu di ritenzione (RT)) hè stata realizata cù Compound Discovery 3.1 è TraceFinder 4.0 (Thermo Fisher Scientific). Per eliminà e potenziali differenze trà i lotti, ogni piccu caratteristicu di u campione di prova hè statu divisu per u piccu caratteristicu di u materiale di riferimentu da u listessu lottu per ottene l'abbundanza relativa. E deviazioni standard relative di i standard interni prima è dopu a standardizazione sò mostrate in a Tabella Supplementare 6. E differenze trà i dui gruppi sò state carattarizate da u tassu di falsa scuperta (FDR <0,05, test di ranghi cù segnu di Wilcoxon) è u cambiamentu di piega (> 1,2 o <0,83). I dati MS grezzi di e caratteristiche estratte è i dati MS curretti per u serum di riferimentu sò mostrati in i Dati Supplementari 1 è i Dati Supplementari 2, rispettivamente. L'annotazione di picchi hè stata realizata in basa à quattru livelli definiti d'identificazione, cumpresi i metaboliti identificati, i cumposti presuntamente annotati, e classi di cumposti presuntamente carattarizate è i cumposti scunnisciuti 22. Basatu annantu à e ricerche in a basa di dati in Compound Discovery 3.1 (mzCloud, HMDB, Chemspider), i cumposti biologichi cù standard validati currispondenti MS/MS o annotazioni di currispundenza esatta in mzCloud (puntuazione > 85) o Chemspider sò stati infine selezziunati cum'è intermedi trà u metaboloma differenziale. L'annotazioni di piccu per ogni caratteristica sò incluse in i Dati Supplementari 3. MetaboAnalyst 5.0 hè statu utilizatu per l'analisi univariata di l'abbundanza di metaboliti nurmalizzati per somma. MetaboAnalyst 5.0 hà ancu valutatu l'analisi di l'arricchimentu di a via KEGG basata annantu à metaboliti significativamente diversi. L'analisi di i cumpunenti principali (PCA) è l'analisi discriminante di i minimi quadrati parziali (PLS-DA) sò state analizate utilizendu u pacchettu software ropls (v.1.26.4) cù nurmalizazione di u stack è autoscaling. U mudellu ottimale di biomarcatori di metaboliti per predisce a malignità di i noduli hè statu generatu utilizendu a regressione logistica binaria cù a minima contrazione assoluta è l'operatore di selezzione (LASSO, pacchettu R v.4.1-3). A prestazione di u mudellu discriminante in i gruppi di rilevazione è validazione hè stata carattarizata da a stima di l'AUC basata annantu à l'analisi ROC secondu u pacchettu pROC (v.1.18.0.). U limite di probabilità ottimale hè statu ottenutu basatu annantu à l'indice massimu di Youden di u mudellu (sensibilità + specificità - 1). I campioni cù valori inferiori o superiori à a soglia saranu previsti cum'è noduli benigni è adenocarcinoma pulmonare, rispettivamente.
E cellule A549 (#CCL-185, American Type Culture Collection) sò state cultivate in un mediu F-12K chì cuntene 10% di FBS. E sequenze di RNA à forcina corta (shRNA) chì miranu SLC7A5 è un cuntrollu senza mira (NC) sò state inserite in u vettore lentivirale pLKO.1-puro. E sequenze antisenso di shSLC7A5 sò e seguenti: Sh1 (5′-GGAGAAACCTGATGAACAGTT-3′), Sh2 (5′-GCCGTGGACTTCGGGAACTAT-3′). L'anticorpi contr'à SLC7A5 (#5347) è a tubulina (#2148) sò stati acquistati da Cell Signaling Technology. L'anticorpi contr'à SLC7A5 è a tubulina sò stati aduprati à una diluzione di 1:1000 per l'analisi Western blot.
U test di stress glicoliticu Seahorse XF misura i livelli di acidificazione extracellulare (ECAR). In u test, u glucosiu, l'oligomicina A è u 2-DG sò stati amministrati sequenzialmente per testà a capacità glicolitica cellulare misurata da ECAR.
E cellule A549 trasfettate cù un cuntrollu senza targeting (NC) è shSLC7A5 (Sh1, Sh2) sò state piastrate per una notte in piastre di 10 cm di diametru. I metaboliti cellulari sò stati estratti cù 1 ml di metanolu acquosu à l'80% fretu cum'è ghiaccio. E cellule in a suluzione di metanolu sò state raschiate, raccolte in un novu tubu è centrifugate à 15.000 × g per 15 minuti à 4 °C. Raccoglie 800 µl di surnatante è asciugate cù un concentratore à vuoto à alta velocità. I pellet di metaboliti secchi sò stati poi analizzati per i livelli di triptofanu utilizendu LC-MS/MS cum'è descrittu sopra. I livelli cellulari di NAD(H) in e cellule A549 (NC è shSLC7A5) sò stati misurati utilizendu un kit culurimetricu quantitativu NAD+/NADH (#K337, BioVision) secondu l'istruzzioni di u fabricatore. I livelli di proteine sò stati misurati per ogni campione per nurmalizà a quantità di metaboliti.
Nisun metudu statisticu hè statu utilizatu per determinà preliminarmente a dimensione di u campione. I studii metabolomichi precedenti destinati à a scuperta di biomarcatori15,18 sò stati cunsiderati cum'è punti di riferimentu per a determinazione di a dimensione, è paragunatu à questi rapporti, u nostru campione era adeguatu. Nisun campione hè statu esclusu da a coorte di studiu. I campioni di sieru sò stati assignati à casu à un gruppu di scuperta (306 casi, 74,6%) è un gruppu di validazione interna (104 casi, 25,4%) per studii metabolomichi senza target. Avemu ancu sceltu à casu 70 casi da ogni gruppu da u set di scuperta per studii metabolomichi mirati. I ricercatori eranu cechi à l'assegnazione di u gruppu durante a raccolta è l'analisi di dati LC-MS. L'analisi statistiche di i dati metabolomichi è di l'esperimenti cellulari sò descritte in e rispettive sezioni Risultati, Legende di e Figure è Metodi. A quantificazione di u triptofanu cellulare, di u NADT è di l'attività glicolitica hè stata realizata trè volte indipindentamente cù risultati identichi.
Per più infurmazione nantu à u disignu di u studiu, vedi u Riassuntu di u Rapportu di Portfolio Naturale assuciatu à questu articulu.
I dati MS grezzi di e caratteristiche estratte è i dati MS nurmalizzati di u serum di riferimentu sò mostrati in Dati Supplementari 1 è Dati Supplementari 2, rispettivamente. L'annottazioni di piccu per e caratteristiche differenziali sò presentate in Dati Supplementari 3. U dataset LUAD TCGA pò esse scaricatu da https://portal.gdc.cancer.gov/. I dati d'input per traccià u graficu sò furniti in i dati surghjenti. I dati surghjenti sò furniti per questu articulu.
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Data di publicazione: 18 settembre 2023